肿瘤动物模型的构建——结直肠癌篇

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)属于世界上第三大最常见的恶性肿瘤。近年来，随着生活水平的提高，国内外结直肠癌的发病率保持着稳定增长的态势，严重威胁着人类的健康。因此，建立合适、可靠的结直肠癌动物模型，对于其病程机理研究和临床药物治疗都具有重大意义。

首先，让我们了解一下结直肠癌发展过程

结直肠癌随着疾病的发展，其遗传学的改变主要包括基因组的不稳定性、癌基因的突变扩增和抑癌基因的突变失活。如下图所示，主要包括APC、KRAS、SMAD2/4、TP53等基因的突变导致正常结肠组织逐渐转化为结直肠癌肿瘤组织并发生远端转移[1]。

根据结直肠癌突变类型，进一步又分为多种细胞系

选择合适的肿瘤细胞系是我们成功构建实验模型和保证研究数据准确的关键。

那么常见的结直肠癌模型有哪些呢？

结直肠癌研究中动物模型主要分为3种类型

一、诱导结直肠癌模型（化学物质、物理、生物等因素诱导）

评价：制作方法简便，重复性较好，广泛应用于肠炎相关性癌症发生和发展的研究。

以应用比较广泛的AOM/DSS诱导结直肠癌模型为例：

二、移植结直肠癌模型（CDTX和PDTX）

评价：成瘤率高、实验周期短，常用于药物研发，是研究中最常用的结直肠癌模型。

再具体了解一下结直肠癌根据移植部位的分类：

1. 皮下荷瘤：实时监测肿瘤的生长情况和评估治疗效果，但不易发生转移。步骤往期已有描述；

2. 尾静脉注射（肺转移）：肺部是结直肠癌常转移器官[2]，主要用于抑制肿瘤肺转移的药物筛选与检测。步骤和数据监测分析，往期已有描述，不再赘述；

3. 脾脏注射（肝转移）：肝脏是结直肠癌最常转移的器官[2]，主要用于抑制肿瘤肝转移的药物筛选与检测。脾脏注射模型具有造模方法简单，转移率高的优点，能较好地模拟结直肠癌术后肝转移的临床特征[3]；

下图所示为脾脏注射大概步骤和视频分析，具体实验步骤细节请参照前文：肿瘤转移动物模型的构建（下）。

脾脏注射详细步骤请参考视频：
https://v.qq.com/x/page/y05165f1l2r.html
温馨提示：请在Wi-Fi下观看，土豪随意

4. 原位移植：既可用于抑制肿瘤生长又可用于抑制肿瘤转移的药物的筛选与检测，弥补了皮下移植和脾脏注射的不足，更能表达临床结直肠癌的生物学特性，是一种更接近人体肿瘤发生、发展过程的模型。

原位移植模型实验步骤：

注意事项：

1. 注意无菌操作；所需的器械和操作台均需灭菌。取肿瘤标本前用酒精棉球对长瘤部位进行擦拭，切取肿瘤标本后，应放在加有抗生素的无血清培养基中，进行无菌操作，操作尽量快速，以提高成瘤率；

2. 对裸鼠进行肿瘤组织移植时，注意不要损坏肠组织的完整，防止瘤块漏出来；

3. 可增加10%的Matrigel增加瘤块的粘附、帮助生长和快速适应肠组织微环境；

4. 在CDTX模型中，根据研究的结直肠癌类型以及基因型选取相应的肿瘤细胞系（参考上表），不同肿瘤细胞系的成瘤率不同，结合自身选取成瘤率高的细胞系进行实验。

数据分析：

如下图：BALB/c裸鼠原位注射腺癌细胞HCT116-GFP后，结直肠癌细胞远端转移到肝脏[4]。

三、基因修饰的结直肠癌模型

评价：肿瘤的发生发展在理论上与原发肿瘤基本一致，主要用于其发病原因、机制等研究，也可用于靶点药物疗效评价实验。随着肿瘤发病机制的研究深入及转基因技术的普及，本法将渐趋成熟。

主要分类：

1. 遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）：HNPCC是APC基因失活致杂化性缺失，错配基因(MLH-l、MLH-2、MLH-6、PMS-1、PMS-2)突变所致。基因敲除MLH-l或MLH-2基因的纯合子小鼠，淋巴细胞会发生瘤变，同时也易患胃肠道的肿瘤，可以作为研究HNPCC很好的模型。

2. 家族性腺瘤性息肉病（FAP）：APC-β-catenin-TCF 主导的Wnt通路失调是FAP 发生的主要途径。APC基因其中一条链的第850号密码子等位突变引起肠道多发性腺瘤，因而被称之为Min(multiple intestinal neoplasia)小鼠，被认为是当前较为理想的家族性腺瘤性息肉病(FAP)的研究模型。

3. 目前也有其他许多靶向敲除的小鼠如Msh2 敲除小鼠、k-ras 敲除小鼠、p53 敲除小鼠等。

数据分析：

以Apc(Min/+)突变小鼠为例，正常C57BL/J6小鼠几乎没有生成结直肠癌肿瘤，而Apc(Min/+)突变小鼠在肿瘤大小和数量上都有显著增加：

根据不同的实验目的合理地选择结直肠癌动物模型，是发表优秀文章不可缺少的实验，本期我们继续不遗余力的为大家综述了多种常用的结直肠癌模型，希望对大家有所帮助。

参考文献：

[1] Davies R J, Miller R, Coleman N, et al. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis[J]. Nature Reviews Cancer, 2005, 5(3): 199-209.

[2] Nguyen D X, Bos P D, Massague J, et al. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization[J]. Nature Reviews Cancer, 2009, 9(4): 274-284.

[3] Okamoto K, Ishiguro T, Midorikawa Y, et al. miR‐493 induction during carcinogenesis blocks metastatic settlement of colon cancer cells in liver[J]. The EMBO Journal, 2012, 31(7): 1752-1763. 

[4] Rajput A, Martin I D, Rose R, et al. Characterization of HCT116 Human Colon Cancer Cells in an Orthotopic Model[J]. Journal of Surgical Research, 2008, 147(2): 276-281. 

[5] Inna Naumov · Alona Zilberberg · Shiran Shapira , et al. CD24 knockout prevents colorectal cancer in chemically induced colon carcinogenesis and in APCMin/CD24 double knockout transgenic mice[J].  International Journal of Cancer . 2014.