肿瘤坏死因子α生物学活性检测

L929rTNF-α

放线菌素DNA酶胰蛋白酶RPMI16403H-TdRPPOPOPOP二甲苯

滤纸培养板吸管滴管试管加样器CO2培养箱显微镜超净台

1.  0.25 ％胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929细胞

2.  用RPMI1640洗涤细胞后，调整细胞浓度至2×10⁶ /ml

3.  加入³H-TdR，20 μci/ml

4.  置37 ℃，5 ％CO₂培养箱中2～3 h，摇动1 次/30 min

5.  用RPMI1640洗涤2次，800 rpm×5 min/次

6.  调整细胞浓度至2～3×10⁵ /ml后，加入96孔培养板中，100 μl/孔

7.  加入不同稀释度的待测样本（设三个重复孔）

　　　　　　　　　
8.  加入放线菌素D，使放线菌素D最终浓度至1 μg/ml，用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准品阳性对照，37 ℃，5 ％CO₂培养中24 h

　
9.  加入3 ％胰蛋白酶和0.25 ％DNA酶各10 μl/孔，37 ℃，30 min

　　　　　　　　　　　　
10.  用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上

11.  烤干后，进行β计数

　
12.  结果判定

　　
（1）TNF-α作用24 h后，在倒置显微镜下判定50 ％L929细胞杀伤的稀释度即为1个TNF-α活性单位。

　　
（2）根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位

　　　　　　　　      放线菌素D对照组cpm-实验组cpm
TNF-α活性单位（U/ml）＝──────────×标准品活性单位×待测样品稀释倍数

                                  放线菌素D对照组cpm-标准品cpm

1.  用于标记³H-TdR的L929细胞要处于对数生长期，否则³H-TdR掺入率低，影响实验结果。

　　
2.  标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的³H-TdR，则会影响完全培基对照组cpm值。

　　
3.  胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，酶均要摸索最适浓度和时间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。

　　
4.  为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过大，一般最终浓度为0.5～1 μg/ml。

　　
5.  在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β（淋巴毒素）的影响。因为TNF-β细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与TNF-α相似。