肿瘤无创诊断技术在癌症检测中应用

　　肿瘤无创诊断技术即液体活检（liquid biopsies）的出现，标志着人类在攻克肿瘤的道路上又前进了一大步。2015年液体活检技术被MIT科技综述杂志（MIT Technology Review）评为年度十大突破技术之一；2017年6月，世界经济论坛与《科学美国人》杂志的专家委员会联合选出的2017年度全球十大新兴技术榜单，其中肿瘤的无创诊断技术成功入选并荣膺榜首。

　　一、液体活检产业链分布

　　从产业链来看，液体活检可分为6个子领域，即上游的捕获、基因扩增、试剂以及仪器市场；中游检测服务市场以及下游数据市场。

　　1. 上游产品技术壁垒高，涉足企业少

　　目前液体活检尤其是CTC检测技术受上游捕获方式的局限较大，是限制液体活检应用的最大难点，器械主要包括CTC分析仪、数字PCR仪、二代测序仪等，试剂盒的关键原材料是抗体和芯片。这些技术、仪器和原材料的生产技术壁垒很高，ZL保护严格，国外公司（赛默飞世尔、奥林巴斯等）形成了高度市场垄断。国内已有几家公司通过并购实现二代测序仪的生产，但产品性能与国外产品相比差距较大，产品同质化严重，竞争激烈。

　　2. 中游检测服务市场企业布局较多

　　液体活检技术可应用于肿瘤的早期筛查、检测、用药指导、评估、观察，贯穿癌症诊治全程，目前液体活检的研究和应用涵盖肿瘤筛查、肿瘤分期分级、预后评估、精准用药（个体化治疗）、耐药监控、肿瘤转移与复发多个领域。更多的企业布局在中游检测服务市场，通过渠道快速占有市场或积累样本厚积薄发。

　　3. 下游环节主要依赖销售能力与测序环节后对数据进行分析处理以及解读

　　数据解读需要对癌症基因组学数据的深度认知作为支持，因此不仅需要联合测序技术与组学研究，还依赖于测序样本的积累，但由于液体活检并不是主要的肿瘤检验方式且价格偏高，尚不能进入医保目录，受众规模小，医院采购量有限，中游企业对销售渠道的依赖比较严重，目前涉足企业有药明康德、华大基因、首度基因、贝瑞和康等少数企业。

　　4. 全国集聚情况

　　对火石数据库中101家液体活检企业全国分布情况进行统计，上海、北京、广州三省市排名前三，分别为20家，19家和17家；其次为江苏和浙江，分别为13家和11家。

　　二、液体活检技术简介

　　目前，临床研究中，液体活检技术主要包括游离循环肿瘤细胞（CTCs）检测、循环肿瘤DNA（ctDNA）检测、外泌体及循环RNA（Circulating RNA）检测等，与传统的组织活检相比，液体活检具备实时动态检测、克服肿瘤异质性、提供全面检测信息等独特优势。

　　1. CTC检测：技术发展快，临床研究热度高

　　CTC技术主要通过检测血液中的循环肿瘤细胞（CTC，Circulating Tumor Cells）的数量来进行诊断。通过对血液中CTC的数量以及蛋白表达、序列检测等可以获取肿瘤的病变信息。目前，CTC主流技术主要分为以下几种：Oncoquick（基于细胞密度对CTCs进行分离）、ISET（依据细胞大小使用孔径约8微米滤膜分离CTCs）、MACS（通过免疫磁珠标记进行上皮性CTCs的分离）、Cell Search（使用EpCAM抗体包被的铁磁珠进行免疫分离）、IFISH-CTC（免疫荧光染色结合FISH技术进行非血缘性细胞染色体异常检测）、RT-PCR（基于肿瘤特异性基因的表达分析）、AdnaTest（通过特定抗原表达和肿瘤相关标志物分离，提取RNA进行RT-PCR分析）、CTC-chip（使用含包被EpCAM抗体微柱阵列的芯片）。

　　截至2018年4月，全球共有CTC检测相关研究589项，其中美国259项，中国96项。

　　在成果转化方面，仅有Immunicon公司的Cellsearch CTC 检测系统2004年通过FDA认证，也是唯一通过FDA批准用于临床的一代CTC检测系统，可以说是行业内的金标准。2012年Cellserach系统通过CFDA认证进入中国市场。Immunicon公司已被强生子公司Veridex所收购。尽管一代CTC技术领先进入临床应用，但目前技术水平尚不完善，只能用于对CTC数量的检测，无法进行进一步的深入检测，加上灵敏度较低，应用局限于转移性乳腺癌、转移性结直肠癌和转移性前列腺癌。

　　2. ctDNA检测：市场处于萌芽期，亟待攻克技术局限性

　　ctDNA技术通过对血液中ctDNA是否携带有肿瘤特异性的突发，或其他基因组改变信息进行检测。研究结果表明，该技术能够真实反映实体瘤组织中的基因突发图谱频率，是治疗效果评价与治疗后临床随访的重要监测指标。ctDNA检测技术目前主要为数字 PCR、BEAMing 技术、标记扩增深度测序（TAM-Seq）、癌症个体化深度测序（Capp-Seq）。

　　ctDNA的检测平台目前有二代基因测序和数字化PCR，可分别对ctDNA的序列信息和序列数量做检测，适用于非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、皮肤癌等常见肿瘤，检测的目标基因目前多以KRAS、PTEN、EGFR、BRAF等热门基因为主。ctDNA的片段捕获需要提前知道和准备待检测突变，突变文库的制备过程繁琐且高成本。与CTC相比，二者均属于液体活检范畴，高灵敏度和低成本，适用于大多数肿瘤检测，并且可同时从血液中提取，获得互补信息。

　　截至2018年4月13日，全球共有ctDNA检测相关研究212项，其中美国56项，中国30项。

　　2016年4月，美国FDA批准了Epigenomics公司以血液为基础筛查结直肠癌的EpiproColon技术。EpiproColon（Septin9基因甲基化检测试剂盒）能检测血液中Septin9基因V2区域发生甲基化的CpG岛bisDNA序列。临床数据显示EpiproColon可检出68%的病例。这是FDA批准的第一款基于ctDNA进行肿瘤筛查的产品。

　　3. 外泌体(exosome)检测，液体活检新技术

　　外泌体与肿瘤发展：外泌体是肿瘤诊断、肿瘤发展和肿瘤治疗的重要参与者。外泌体的主要功能就是递送各种生物分子，包括蛋白质、多肽配体、DNA和RNAs。因此肿瘤细胞分泌的外泌体在肿瘤发展和治疗中扮演角色主要表现在以下方面：1、促进肿瘤细胞发展，侵袭和转移；2、促进肿瘤的血管新生；3、肿瘤免疫调节；4、肿瘤化疗的增敏作用。

　　通过超速离心法或者磁珠法提取外泌体后，分离纯化出来的exosome可以做蛋白研究，也可以做RNA（microRNA和LncRNA）研究，36%的研究人员通过Western blot或其他方法来鉴定蛋白，29%的人员利用qPCR对microRNA表达谱进行分析，9%利用芯片进行microRNA表达谱分析。同时，新一代测序的用户也不少，13%的人员利用NGS开展microRNA/小RNA研究，9% 开展mRNA研究，另外基于组学研究的质谱分析法也越来越常用。外泌体分析数据库 ExoCarta，目前已包含9769种蛋白质，4946种mRNA条目，3408种mRNA，2838种miRNA，1116种脂质条目。

　　外泌体（exosome）近年来成了研究领域里的明星，大量的相关研究见诸报道。尤其2015年以来外泌体研究与应用飞速发展，国自然基金外泌体中标项目和文章发表数量大幅增加。

　　目前外泌体的大部分工作还是停留在科研阶段，后续的生物标志物开发和验证不多，而诊断和疗法的开发就更少。研究者认为，exosome的定性和定量研究是个快速发展的市场。同时，循环生物标志物的市场也存在着机遇和挑战。

　　三、液体活检行业面临的问题

　　1. 液体活检仅被作为替补方案，难以抢占传统活检市场份额

　　患者如何在液体活检和组织活检之间选择，取决于检查的目的是什么。许多肿瘤的CTC、ctDNA数量不足或者肿瘤存在明显异质性，导致肿瘤即使突变，液体活检试剂盒也不一定能捕捉到CTC或ctDNA，血液检查结果可能出现假阴性。因此只要患者能够提供足够的组织样本，初始诊断优先选择组织活检；如果组织样本不足量，液体活检可以是替补方案。因此，液体活检不会替代其他检查方式，也难以抢占传统活检的市场份额。

　　2. 液体活检尚未进医保，价格高，推广难度大

　　低通量液体活检产品价格低廉，但是检出率也较低，应用前景有限。高通量产品对部分肿瘤的检出率高达80%-90%，但价格偏高。同时，这类产品尚未纳入医保目录，普通民众较难独立接受如此高昂的价格。

　　3. 对ctDNA产品的可靠性质疑

　　年初，美国临床肿瘤学会（ASCO）在《Journal of Clinical Oncology》杂志发表的综述文章，对ctDNA的分析有效性、临床有效性和临床实用性提出质疑。调查结果显示：（1）以前的部分研究指出，ctDNA更适合用于晚期癌症的筛查，而非用于临床早筛，但是目前看来，即使用于晚期癌症，其有效性和合理性也没有足够的证据来证明；（2）还没有足够的证据支持常规使用ctDNA检测早期癌症，并以此做出治疗决策、监测治疗效果、寻找残留癌细胞；（3）液体活检与组织检测经常结果不一致，因此阴性液体活检结果应与肿瘤组织基因分型对比确认。文章强调，ctDNA检测结果必须与其他信息结合，才能为患者提供最佳选择。

　　四、结语

　　液体活检是一项具有挑战性的新技术，随着研究的不断深入，越来越多的研究成果将有望实现成果转化，液体活检将成为肿瘤诊断的重要技术手段。液体活检要广泛进入临床应用也面临众多挑战，不仅需要检测技术灵敏度和特异性的提升、临床研究的广泛积累，还需要建立相应的检测标准、建设规范的监管体系。