肿瘤细胞的软琼脂集落培养实验

在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有这种能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。

HL-60细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞，在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落。二甲基亚砜是一种细胞分化诱导剂，经二甲基亚砜处理后的HL-60细胞按粒系途径定向成熟分化，同时细胞的增殖力降低，几乎全部细胞丧失了软琼脂中形成集落的能力。

HL-60细胞

小牛血清 RPMI1640培养液 台盼兰 琼脂 二甲基亚砜

超净工作台 二氧化碳培养箱 显微镜 培养瓶 吸管 酒精灯 血细胞计数板 多孔培养板

1.  收集对数生长期的HL-60细胞，先按实验十三测定细胞活力，然后调整细胞浓度，制成300~1 000活细胞/ml 的细胞悬液。

2.  取二个培养瓶每个瓶中加9 ml 调整好浓度的细胞悬液，然后各加入1 ml 3%琼脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混匀。

3.  用微量加样器吸140 ul 二甲基亚砜（MDSO），加到一个瓶中，充分混匀，为实验组，另一瓶不加DMSO，为空白对照组。

4.  取一个16 mm 多孔培养板，每孔加1 ml（35 mm 培养皿需加2 ml）细胞琼脂悬液，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。

5.  在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。

6.  然后移培养板或平皿于CO₂培养箱中37℃进行培养。

7.  培养7~10天，肉眼观察并计数细胞集落。

8.  结果：以肉眼可见的细胞团（含500个以上细胞）作为计数集落的标准。对照组HL-60细胞在含0.3%的软琼脂培养基中生长良好，每个孔中可见有多个集落形成，而实验组HL-60细胞因经二甲基亚砜诱导分化，细胞在软琼脂中的集落形成明显减少。

9.  集落的计数和计算：

（1）集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔

（2）集落形成率=集落数/接种培养细胞总数x100%

1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：1）高压蒸汽灭菌15分钟以上，2）干烤消毒140度2小时以上。

2.消化液（pH7.8）或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存。

3.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上。

4.培养基（pH7.2）和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存。

5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌），至少每月一次。

6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，肿瘤细胞培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶（盖）时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。