脂质体介导的瞬时转染

实验材料 靶细胞DNA

试剂、试剂盒 阳离子脂质D-PBSA缓冲盐溶液NaCl 0.25%胰蛋白酶

仪器、耗材 细胞培养基还原的血清培养基无血清培养基多孔培养板

实验步骤

A . 贴壁细胞的转染

1. 将 1.3X105 个细胞/孔接种到 6 孔培养板，加 3 ml 培养基。

2. 于 37°C 的 CO2 孵箱培养至 50%~90% 汇合。这一过程至少需 16 h , 通常为 18~24 h。

3. 转染前，在无菌试管中制备 DNA 及脂质体溶液：

(a) 对于 DNA 溶液，将 1~2 μg DNA 在 0.5 ml 的还原血清中稀释

(b) 对于脂质体溶液，取 2~25 μl 的阳离子脂质试剂稀释到 25 μl， 再加入 0.5 ml 的无血清培养基（无血清或抗生素的 DMEM）。

阳离子脂质

Lipofectamine: 多价阳离子脂质体 DOSPA 与中性脂质体 DOPE 3 : 1 (w /w )混合物（Invitrogen )

Lipofectin: 即阳离子脂质体 DOTMA (N -[l -(2，3 dioleyloxy)-propyl]-N，N ,N -trimethylamonium chloride) 与中性脂质体 DOPE 1 : 1 (w /w ) 混合物（Invitrogen)

LipofectACE : 为合成阳离子 DDAB 脂质体与神经脂质 DOPE 体1 : 2.5 (w /w )混合物（Invitrogen )

(c) 将两溶液混合，小心混勻，然后室温下静置 15~45 min，以使 DNA -脂质体形成混合物。

4. 用 2 ml 无血清培养基漂洗细胞。

5. 将 DNA-脂质体混合物铺布在培养细胞之上，转染试剂应不含抗生素。

6. 将转染细胞于 37℃ 的 CO2 培养箱孵育 2~24 h ，一般 5~6 h 即可。

7. 孵育后，弃除转染混合物，改加 3 ml 完全培养基。

8. 18~24 h 后换液（仍为完全培养基）。

9. 依实验要求，吸取培养基或收获细胞，测定基因瞬时表达的活性（见方案 27. 14 和方案 27. 15)。

B. 悬浮细胞的转染

1. 在无菌试管中制备转染的混合物，如下所示：

(a) 将 2.5 μg DNA 以 0.5 ml 的还原血清培养基稀释。

(b) 将 2~20 μl 阳离子脂质体试剂以 0.5 ml 无血清培养基稀释。

(c) 混合两种溶液，轻轻混匀，然后于室温下孵育 15~45 min，使 DNA-脂质体混合物形成。

2. 将 1X106~2X106 个细胞悬浮液离心，弃去培养基。

3. 在转染混合液中将细胞再制成悬浮液，将其转移至一个 35 mm 培养皿。

4. 在 CO2 培养箱中孵育细胞 4~6 h。

5. 向每个培养皿中加入 0.5 ml 含 30 % 血清的培养基（悬浮细胞对脂质试剂的毒性极为敏感，为避免细胞破坏，应加大量的血清保护细胞）

6. 在 CO2 培养箱中过夜培养。

7. 次日，向每个培养贩中加入 2 ml 完全培养基，在 CO2 培养箱中继续培养。

8. 在转染后 24~72 h ，依实验要求，吸取培养基或收获细胞，测定基因瞬时表达的活性（见方案 27. 14 和方案 27. 15)。