脂质体介导DNA转染法

脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。

细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

1、操作步骤（方法一）：

（1）细胞培养：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 105个细胞的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。

（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。

A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100u。

B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100u。

轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。

（3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。

（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。

（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。

（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：

将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。

在试管中配制DNA-脂质体复合物。

a、在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。

b、旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。

c、室温下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。

弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。

再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。

吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2m/孔，再培养24-48h。

用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染法：

接种细胞同前述，细胞长至50%板底面积可用于转染。

DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。

在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培养48h。

吸出DMEM，用G418选择性培养基稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。