脂质体转染的几个实验方法

实验概要

本实验介绍了脂质体转染的几个方法。

实验原理

脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。

细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

实验步骤

1. 操作步骤(方法一)：

   1) 取6孔培养板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10⁵个细胞的培养基，37℃、18% CO₂培养基40%-60%汇合时。

   2) 转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量)。

      A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。

      B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。

轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。

   3) 转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。

   4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。

   5) 其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。

   6) 注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2. 快速脂质体转染法操作步骤(方法二)：

   1) 将细胞以5 x 10⁵个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。

   2) 在试管中配制DNA-脂质体复合物。

      a. 在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。

      b. 旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。

      c. 室温下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。

   3) 弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。

   4) 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。

   5) 吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培养24-48h。

   6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3. 稳定的脂质体转染法：

   1) 接种细胞同前述，细胞长至50%板底面积可用于转染。

   2) DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。

   3) 在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培养48h。

   4) 吸出DMEM，用G418选择性培养基稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。

4. Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。(别的方法可以参考生产商提供的protocol)

   1) 转染前1天将0.5～2×10⁵细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。

   2) 准备复合物

      a. 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。

      b. 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀，室温孵育5分。注意：必须在25分内进行。

      c. 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。

   3) 吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。

   4) 将复合物(总体积100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。

   5) 将细胞放入培养箱孵育4～6h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。

   6) 24～48h后可以观察转入基因表达情况。

   7) 稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代，1天后更换筛选培养基筛选。

   8) 优化：要保证细胞汇合率达90～95％(比较高)；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般细胞1：2～3。