脉冲场凝胶电泳的分子质量标准

噬菌体 T4 DNA 连接酶 纯化的噬菌体 λDNA

ATP Dithiothreitol EDTA 连接缓冲液 低熔点琼脂糖缓冲液 聚乙二醇 TE

低熔点（LMT ) 琼脂糖 Tygon 管 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

ATP ( 0.1 mol/L)

Dithiothreitol ( 1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)

含聚乙二醇的 1X 连接缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH7.6)，1 mmol/L ATP，10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，10 mmol/L MgCl₂，2% PEG 8000）

低熔点琼脂糖缓冲液（100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，20 mmol/L MgCl₂）

MgCl₂ ( 20 mmol/L)

聚乙二醇（8%, m/V，PEG 8000 溶液）

TE (pH7.6)

2. 酶和缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

3. 凝胶

低熔点（LMT ) 琼脂糖

4. 核酸和寡核苷酸

纯化的噬菌体 λDNA

5. 专用设备

Tygon 管

56℃ 水浴

二、方法

1. 在 10 ml LMT 缓冲液中通过沸水浴或微波加热溶解 0.1 g 低熔点琼脂糖。冷却到 37℃。

2. 在 172.5 μl TE (pH 7.6) 中溶解 10 μg 纯化的噬菌体 λDNA, 加热该溶液至 56℃  5 min。

3. 冷却溶液到 37℃，迅速按顺序加入下述试剂：

8%PEG8000                    62.5 μl

20 mmol/L MgCl₂             5.0 μl

0.1 mol/L ATP                  5.0 μl

1 mol/L DTT                     5.0 μl

噬菌体 T4 DNA 连接酶      0.5 Weiss 单位

1% LMT 琼脂糖溶液         250 μl

聚乙二醇起集聚剂的作用，增加连接效率。

4. 混合物吸入一个稍短的 Tygon 管，在冰上冷却至琼脂糖完全凝结。

5. 将凝胶栓移入一个无菌的一次性塑料管内，其中有 3 倍体积的含聚乙二醇的1x 连接缓冲液。

6. 凝胶栓在连接缓冲液内室温温育 24 h, 然后转移到 10 倍体积 20 mmol/L EDTA ( pH 8.0）的试管内。

7. 在 EDTA 中温育 1 h, 再将凝胶栓转移到新鲜 10 倍体积 20 mmol/L EDTA (pH 8.0) 的试管内。