【HPLC结合在线固相萃取对苯并芘进行测定】
本文利用双三元液相色谱仪,通过在线固相萃取建立腊肉香肠中苯并[a] 芘的检测方法,在现行国家标准基础上,进一步简化前处理方法、并确保分析过程更加灵敏、快速、准确。
苯并[a] 芘(英文缩写BaP)属多环芳烃类化合物,是一种常见的高活性间接致癌物质(结构式见图1)。
图1. 苯并[a] 芘化学结构图。
食物中的BaP 通常源自加工过程,当食材经高温处理时,所含的氨基酸和油脂类成分可通过裂解或热聚合生成BaP,若加工温度较高(如400 ~ 1000 ℃),BaP 生成量将会急剧增加。由于腊肉、香肠等制品通常会经过烘烤或烟熏处理,生成BaP 的可能性相对较大,因此需要对其所含的BaP 加以严格控制。目前我国国标限定粮食和肉制品中Bap 的残留量应在5 μg/kg 以下,相应的国家标准及文献方法如表1 所示。
表1. 肉类产品中苯并[a] 芘的前处理方法
经比较发现,上述方法的前处理过程均较为繁琐,耗时较长,不便于大量样品的快速检测。本方法使用双三元高效液相色谱系统(DGLC-3600),采用在线固相萃取(Online SPE)技术,首先将样品中难洗脱的动物油脂等成份保留在富集柱上(在线净化),然后通过切换阀将易洗脱的目标物转入分析柱进行HPLC 分离,从而有效降低基质成份对目标物的干扰。该方法可实现样品自动化前处理,方法快速简便(测试周期约为30 min),灵敏度高(检测
限按供试品取样量折算可达0.15 μg/kg),且精密度和回收率好,适于大批次样品的快速检定;SPE 小柱可在分析过程中在线净化,重复使用,大大节省测试成本
仪器
高效液相色谱仪(Thermo Scientific Dionex Ultimate DGP 3600系列,包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵,自动进样器,带有一个六通阀的柱温箱,荧光检测器,仪器连接参见图2。)
超纯水机(Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC,P/N:50131948)
台式离心机(Thermo Scientific Sorvall ST16,P/N:75004240)
旋转蒸发仪(Thermo Scientific RV10 V,P/N:IKA8022525)
匀浆机(Seward Stomacher 80,P/N:SWD0080/000/EU)
试剂和对照品
甲醇(色谱纯,Fisher Chemical,P/N: A452-4)
乙腈(色谱纯,Fisher Chemical,P/N: A998-4)
乙酸乙酯(色谱纯,Fisher Chemical,P/N: E195-4)
无水硫酸钠(分析纯,Fisher Chemical,P/N: S429-500)
苯并[a] 芘标准品(Dr. Ehrenstorfer GmBH,99.6 %)
标准品溶液制备
称取苯并[a] 芘标准品 5.39 mg,置100 ml 棕色量瓶中,以甲醇溶解定容至刻度;再精密量取该溶液1.0ml,以甲醇稀释定容至50ml,作为标准品储备液(浓度1.074 μg/ml)。取标准品储备液以甲醇逐级稀释为浓度分别为53.89、10.74、5.376、1.068、0.534、0.107 ng/ml 的标准工作溶液。
样品溶液制备
取样品,以绞肉机搅碎混匀后,准确称取2.0 g,加入无水硫酸钠2.0 g,置50 ml 离心管中,先后以乙酸乙酯20 ml 均质提取2 次,每次1 min,然后于8000 转/ 分下离心2 min;合并两次上清液,于55 ℃下旋转蒸发浓缩至2 ml 以下,以乙酸乙酯转移至10 ml 量瓶,定容至刻度,过0.45 μm 有机滤膜后待测。
加标溶液制备
取搅碎后样品2.0 g,准确加入1ml 标准品溶液,氮气吹干后,照样品溶液制备法“加入无水硫酸钠2.0 g…”及后续方法操作,即得。
色谱条件
分析柱:Acclaim Phenyl-1 3 μm,4.6 ×150 mm(P/N: 071969,S/N: 001059);
富集柱:Acclaim C8 5 μm,4.6 ×10 mm(P/N: 069696,Lot No: 101111);
流动相:流动相组成见表2;富集泵梯度及阀切换条件见表3;
流速:富集泵1.0 ml/min;分析泵1.0 ml/min;
进样量:10 μl;
柱温:35 ℃;
荧光检测器:激发波长290 nm,发射波长410 nm,灵敏度 1;
图2. 仪器连接图。
表2. 淋洗液组成及流速
表3. 富集泵( 左泵) 梯度淋洗条件
标准品色谱图(1.068 ng/ml)
图3. 标准品测定色谱图。
样品及加标样品色谱图(加标量为 5 μg/kg)
图4. 样品及加标样品测定色谱图(上- 样品;下- 加标样品)。
样品前处理方法优化
分别采用乙腈、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷对样品进行提取,结果发现乙腈、异丙醇提取效率较低(回收率仅50%);正己烷极性太小,制得的供试品溶液油脂含量较大,可能导致固相萃取柱过载,且正己烷挥发性过强,可能影响进样精密度;而采用乙酸乙酯提取,回收率相对较好,富集泵可对SPE 小柱有效净化,减少不同样品间干扰;加入无水硫酸钠可对样品溶液进行脱水处理,进一步减少干扰。
色谱柱选择
富集柱选择:为了尽可能减少油脂成份在SPE 小柱上的洗脱时间,提高分析速度,优选Acclaim C8 作为在线SPE 柱。分析柱选择:分别选择Hypersil Gold C18、Accucore C18、
Acclaim Phenyl-1 色谱柱对样品和对照进行分离,结果发现Acclaim Phenyl-1(苯基柱)分析,苯并[a] 芘峰形最好,与其他杂峰的分离最佳,故最终选择Acclaim Phenyl-1 色谱柱作为分析柱。
方法的重现性
取浓度为1.068 μg/ml 的对照品溶液重复进样5 针,保留时间RSD 为0.04 %,色谱峰面积RSD 为0.96 %。制备加标量5 μg/kg 的供试品溶液5 份,分别进样1 针,保留时间RSD 为0.07 %,色谱峰面积RSD 为2.40 %。
图5. 加标样品重复性测定色谱图。
线性、检出限
取不同浓度苯并[a] 芘标准工作溶液依次进样10 μl 分析,在0.107 ng/ml ~ 53.89 μg/ml 范围,以苯并[a] 芘浓度和峰面积进行线性回归,标准曲线为A = 8254.2783 C + 208.3219,
相关系数1.0000。取浓度为0.107 ng/ml 的苯并[a] 芘对照品溶液,进样3 μl分析,苯并[a] 芘峰高值约为噪音值三倍,本方法检出限为0.3 pg(按对照品进样量折算);最低检出浓度为0.15 μg/kg(按供试品取样量折算)。
图6. 方法检测线测定色谱图。
实际样品的分析
取市售的样品,分别照GB/T 5009.27-2003 和本方法进行测试,结果见表4。
表4. 样品检测结果
取5# 样品进行加标回收试验(色谱图见图5),加样回收率均在95 %~105 % 之间,平均回收率为98.51 %,RSD =2.40 %(n
= 5),说明本方法的准确度较高;采用国家标准GB/T
5009.27-2003(提取净化后的样品溶液采用纸色谱分离,荧光分光光度计测定)未能检出样品中苯并[a]
芘,初步推测是由于该方法灵敏度相对较低所致。
本方法使用在线固相萃取方法对腊肉香肠中苯并[a] 芘进行测定,操作简便易行,减少了手动操作步骤,提高了方法重现性和准确度,适用于该类样品的快速检测。
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