腺苷酸环化酶的电镜酶细胞化学试验方法

　　腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。它也是一种磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'－环磷酸腺苷（cAMP）并释放出焦磷酸。

　　Howell等人（1972）首先用亚胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地对动物细胞中的腺苷酸环化酶进行了定位。现已确认，在未固定和固定的组织中，ATP－PNP是腺苷酸环化酶的专一性底物，在腺苷酸环化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者与捕捉铅离子反应，生成一种不溶性的电子密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性，为克服这一缺点， Fujiomto等（1981）设计了使用二钾亚砜（DMSO）的硝酸铅法。下面介绍的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸铅法。

　　固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含8%蔗糖、5%的DMSO。

　　固定液配方： 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。对于肝脏来说，1%以上的戊二醛固定时，可导致明显的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能较好保存。总体来说，多聚甲醛与戊二醛的浓度应因组织而异。一般在0～4℃固定2小时或室温固定1小时。

　　洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时～过夜，期间更换缓冲液数次；而后进行厚切片；

　　孵育：配方及条件见\ref{table:Enzyme-7},

　　作为腺苷酸环化酶特异底物的AMP－PNP在室温中或长期冷冻保存时，ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，应引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP－PNP 容易受到组织的碱性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制该酶的活性，在碱性磷酸酶活性高的组织内，左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑。氟化钠为腺苷酸环化酶的激活剂，应根据组织不同进行前处理后，将氟化钠加入到孵育液中。

　　后固定：后固定前，必须用不含DMSO的二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤。

　　残存的DMSO可以与锇酸反应，产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1%～2%的锇酸。锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响，有人认为固定时间不应超过10min，超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散，有时由于全部溶出而导致完全没有反应产物的阴性结果。因此认为用锇酸固定时间最好控制在5分钟内。也有用2～4%的戊二醛代替锇酸进行后固定。