色谱期刊：UPLCQTOFMS快速辨识芪玉三龙汤化学成分

　　色谱, 2021, 39(7): 730-743

　　DOI: 10.3724/SP.J.1123.2020.10016

　　黄梦文, 吴欢*, 于伟, 王影, 汪逢灿, 张纯纯, 周龙生, 李泽庚

　　芪玉三龙汤(Qi-Yu-San-Long decoction, QYSLD)是由黄芪、玉竹、天龙、地龙、龙葵、白花蛇舌草、薏苡仁、泽漆、莪术、川贝母十味中药组方而成,是临床用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的名老中医验方。

　　现代药理学研究表明,QYSLD抑制NSCLC的作用可能与其调控PI3K/Akt/mTOR和Wnt/β-catenin信号转导通路分子表达有关。虽然QYSLD能有效治疗NSCLC,但其发挥抑制NSCLC作用的物质基础尚未明确。

　　中药(复方)中的复杂化学组分具有多靶点和协同效应的治疗作用特点,对这些复杂化学组分进行解析是揭示中药(复方)药效物质基础并对其进行质量控制的关键步骤。因此,有必要建立一种快速、可靠的分析方法全面表征QYSLD中的复杂化学成分。

　　近年来,具有高灵敏度、高分辨率的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)已广泛用于中药(复方)化学成分的分离和结构表征中。质谱数据采集主要分为数据依赖性采集和数据非依赖性采集(DIA),其中DIA技术无需对样品中的化合物作预选择,而是直接采集经色谱柱分离的所有化合物的质谱信息。作为典型的DIA技术之一,全信息串联质谱(MSE)是一种能够实现“低碰撞能”和“高碰撞能”交替扫描以获得高精确的母离子及碎片离子信息,并能够依据母离子和碎片离子的色谱行为进行关联归属的数据采集方法。

　　由于中药(复方)众多成分之间含量差异大、结构类型和理化性质多样,传统人工解谱费时耗力；在存在基质背景信号干扰的情况下,质谱响应信号低或含量很少的成分在MSE模式中的信号贡献较小,这些成分在分析鉴定过程中,常易产生漏判。因此,依托于天然产物后处理筛查(UNIFI)平台的靶向筛查方法便成了很好的补充。UNIFI平台可极大减轻以往质谱数据分析的工作量,能对MSE低能量下采集的数据自动进行离子流提取和分子式确定,并与自建库中成分作靶向筛查,然后根据MSE高能量下的碎片信息推导化合物裂解途径,最后在预设的过滤条件下输出识别成分的结构信息,对中药及复方中的化学成分进行快速识别。

　　本研究在前人研究的基础上构建了QYSLD化学成分库,并将其导入UNIFI平台；然后利用UPLC-QTOF-MS的DIA技术采集样品信息,再结合靶向筛查方法快速辨识QYSLD的化学物质基础,共辨识出166种化合物,并通过对照品对其中16种主要化学成分予以确认。该研究将为下一步研究QYSLD中发挥抑制NSCLC的药效成分奠定基础,同时也为其他中药(复方)成分分析提供方法参考。

　　混合对照品溶液的制备

　　精密称取16种对照品适量,用甲醇溶解定容,配制成对照品储备液。取各对照品储备液10 μL,用甲醇稀释定容,配制成各成分质量浓度约为10 μg/mL的混合对照品溶液,过0.22 μm的微孔滤膜。

　　样品前处理

　　QYSLD样品溶液的制备:称取黄芪30 g、玉竹10 g、天龙6 g、地龙6 g、龙葵20 g、白花蛇舌草20 g、薏苡仁20 g、泽漆6 g、莪术10 g、川贝母6 g。加入1340 mL水,浸泡1 h,武火煮沸后文火煎1.5 h,滤过；残渣加入1072 mL水,武火煮沸,文火煎40 min,滤过；合并两次煎煮液浓缩至1 g/mL。取2.5 mL浓缩液与7.5 mL 95%乙醇混合,涡旋混匀,避光放置12 h,取上清液减压离心挥干,残渣加甲醇振摇溶解,定容至50 mL,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜过滤后装入进样小瓶。

　　空白溶液的制备:除不加药物外,其他步骤与QYSLD样品溶液相同。

　　液相色谱条件

　　色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),柱温:35 ℃,流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液、B为乙腈,流速:0.2 mL/min。梯度洗脱程序:0~7 min, 3%B~15%B； 7~11 min, 15%B； 11~21 min, 15%B~25%B； 21~26 min, 25%B~35%B； 26~36 min, 35%B~55%B； 36~45 min, 55%B~73%B； 45~51 min, 73%B~85%B； 51~56 min, 85%B~95%B； 56~61 min, 95%B； 61~62 min, 95%B~3%B； 62~65 min, 3%B。进样量:2 μL。

　　质谱条件

　　离子源为电喷雾电离(ESI)源,分别采用正、负离子模式检测,实时校正液为亮氨酸脑啡肽。离子源温度120 ℃；扫描范围为m/z 50~1200,毛细管电压3.0 kV(正离子模式)、2.5 kV(负离子模式)；锥孔电压40 kV；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂气体流速:600 L/h。MSE低碰撞能量为6 eV, MSE高碰撞能量为20~35 eV。

　　QYSLD化学成分数据库的建立

　　通过检索CNKI、Medline、PubMed、Chemicalbook和ChemSpider等数据库,收集、整理QYSLD中十味中药所含化学成分的信息(包括351种化学成分名称,分子式及结构式),结构式使用ChemDraw绘制,文件格式保存为mol格式。

　　数据分析

　　将MSE低碰撞能量(获得准分子离子或加合离子精确质量数)、高碰撞能量(设置碰撞能量区间,获得特征碎片离子、中性丢失等二级质谱信息)所采集到的QYSLD样品溶液、空白溶液质谱信息和原文1.6节下建立的QYSLD化学成分库均导入UNIFI平台。UNIFI阈值设定:二维检测最小峰面积为200； 三维检测的低、高碰撞能量下峰强度分别设置为500和150；保留时间偏差为±0.1 min；精确质量数偏差为±5×10-6；正离子模式下,选择[M+H]+和[M+Na]+为准分子离子或加合离子；负离子模式下,选择[M-H]-和[M+HCOO]-。在上述阈值的过滤条件下对待测成分的离子峰进行自动辨识、校正并输出结构信息。然后结合准分子离子、碎片离子的精确质量数及部分对照品对化合物结构进行确认。

　　结论

　　本研究运用UPLC-QTOF-MS的DIA技术(MSE模式)结合靶向筛查方法对QYSLD中复杂的化学成分进行快速、全面的分析,结果从QYSLD中共识别出166个化学成分,其中16个成分经过对照品验证。本研究所建立的方法能够快速、可靠的表征QYSLD中的化学成分,为该复方的药效物质及质量控制研究奠定了基础,同时也为其他中药(复方)所含化学成分的快速解析提供方法参考。但UNIFI平台靶向筛查方法也有不足,如无法区分准分子离子和二级碎片离子均相似的同分异构体。因此,需通过tR、精确准分子离子质量、碎片离子质量、文献信息及对照品的色谱、质谱信息等对UNIFI平台靶向筛查的可疑化合物进行复核,以排除假阳性结果。