色谱柱填料的种类及选择（二）

二、怎样选择填料粒度

　　目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高;小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是仅有的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

　　三、如何保证良好的柱性能与柱寿命

　　◆ 认证阅读色谱柱使用说明书;

　　◆ 使用填充良好的色谱柱;

　　◆ 尽量减少压力波动，避免机械及热冲击;

　　◆ 使用保护柱及在线过滤器;

　　◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱;

　　◆ 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分;

　　◆ 用稳定的固定相(C18最稳定);

　　◆ 在中等PH值操作(6~8)，用有机缓冲溶液;

　　◆ 色谱柱使用温度好小于40℃;

　　◆ 硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0;

　　◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;

　　◆ 流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%;

　　◆ 过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存(乙晴好)。

(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

　　反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

　　(2)、聚合物填料

　　聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

　　(3)、其他无机填料

　　其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

　　二、怎样选择填料粒度

　　目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高;小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是仅有的的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

　　三、如何保证良好的柱性能与柱寿命

　　◆ 认证阅读色谱柱使用说明书;

　　◆ 使用填充良好的色谱柱;

　　◆ 尽量减少压力波动，避免机械及热冲击;

　　◆ 使用保护柱及在线过滤器;

　　◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱;

　　◆ 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分;

　　◆ 用稳定的固定相(C18最稳定);

　　◆ 在中等PH值操作(6~8)，用有机缓冲溶液;

　　◆ 色谱柱使用温度小于40℃;

　　◆ 硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0;

　　◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;

　　◆ 流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%;

　　◆ 过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存(乙晴)。