花粉管中线粒体移动的活体动态观测

实验概要

在本实验中，应用Mitotracker Red染料对花粉管中线粒体进行活体标记，并结合激光共聚焦显微镜和隐失波显微镜技术，研究了花粉管细胞骨架及其相应的马达蛋白等对于线粒体分布、线粒体的移动和停泊的调节作用。

主要试剂

MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) 50 μg药品加入94 μL DMSO溶解，配成1 nmol/μL的母液，-20℃避光保存。

主要设备

激光共聚焦显微镜ZEISS LSM 510 META (Germany)

倒置显微镜 (IX81; Olympus)

高孔径物镜 (Apo 1003 OHR，NA 1.65，Olympus)

实验材料

青杄花粉。称取10 mg青杄花粉悬浮培养于液体培养基中，置摇床(125 rpm)中，24℃恒温培养。培养基含有12% 蔗糖   0.01% H₃BO₃   0.03% CaCl₂，pH 6.4 (PBS)。

实验步骤

1. 抑制剂处理

所有的化学试剂来自于Sigma  (St Louis, MO, USA)，除非有特别说明。1mM latrunculin B (LATB)，1mM taxol和100 μM  jasplakinolide (Molecular probes, Eugene, OR, USA)  储存液用DMSO配制，-20°C下保存。2,3-butanedione 2-monoxime (BDM) 溶液现配现用，用双蒸水配制成 500  mM 母液。20mM  oryzalin母液用100% ethanol 配制，-20°C保存。抑制剂处理时直接将母液加入培养18  h的青杄花粉管中，孵育5-10 min。各种药物处理的最终浓度为LATB 10 nM，Jas 100 nM，oryzalin 100  μM，taxol 5 μM，BDM 50 mM。

2. MitoTracker染色

收集各种抑制剂处理的青杄花粉管，加入MitoTracker Red CMXRos，使其终浓度为250 nM, 室温孵育5 min，显微镜观测。

3. 线粒体的显微观察

激光共聚焦显微镜的观察采用ZEISS LSM 510 META (Germany)系统，63ⅹ水镜，激发波长为514 nm，采集滤光片为560--640 nm.

隐失波荧光显微镜是在倒置显微镜的基础上构建的。多通道氩离子激光发射器发出的光  (458，488，515 nm，30 mW) 通过单模块光纤维和三组照明镜头聚焦在高孔径物镜 (Apo 1003 OHR，NA  1.65，Olympus)  的背面，从而产生隐失波，允许样品表层的荧光被激发。通过调节入射光的角度可以收集到不同样品深度的荧光。MitoTracker 的激发波长为514  nm。荧光通过100倍油镜，530-600 nm滤光片，由电耦合CCD (Micromax, MMX-512-BFT，Princeton  Instruments)以200 ms/帧的速度收集time-lapse图像序列。

4. 花粉管微丝的标记

    将不同抑制剂处理的花粉管在新鲜配制的4%多聚甲醛 (50 mM Pipes buffer, pH 6.9)  固定1h，固定时同时抽气几分钟。用50 mM Pipes buffer洗涤三次，花粉在含有1%果胶酶和1%纤维素酶的50 mM Pipes  buffer37℃下孵育15 min。用50mM Pipes buffer洗涤三次后，样品再用1%Triton -100室温孵育40min。50  mM Pipes buffer洗涤三次后，样品用0.2 nM phalloidin-TRITC溶于PBS (pH 6.9)  buffer暗处理1 h。滴入50%甘油 (含抗荧光淬灭剂)，用指甲油封片。在激光共聚焦显微镜 (ZEISS，META510)  下，Ar/Kr激光，激光波长515 nm。每个样品取20－30个不同光学切片扫描，最后将所有光切面的图象叠加成像。