荧光分光光度计结构与组成

一、组成

荧光分光光度计的基本组成部件包括：激发光源、单色器、样品室、检测器、显示系统。

二、激发光源

光源提供激发样品的激发光，常见的激发光源有高压氙灯、高压汞蒸气灯、激光器、闪光灯等。高压氙灯能发射出强度较大的连续光谱，且在300～400nm范围内强度几乎相等，成为目前应用最多的连续光源。高压氙灯的外壳为石英玻璃，内部充压力为5倍标准大气压的氙气，工作时压力可达到20倍标准大气压。以激光器作光源时，激发光强度大且单色性好，能极大地提高荧光分析的灵敏度。以激光器作为光源的高性能荧光仪可实现单分子检测，但存在激发光一般为单波长，不能调整入射光的能量，且价格昂贵，使用上受限制的缺点。此外，目前商品仪器中应用较多的闪光灯有氢灯、氮灯、脉冲激光灯等类型。

三、单色器

单色器用来分离出所需要的单色光。早期的荧光计是以滤光片来分离单色光，现在荧光分光光度计中应用最广的是光栅单色器。一般地，荧光分光光度计上装有两个单色器，激发单色器和发射单色器。置于光源和样品室之间的为激发单色器，筛选出特定的激发光谱。置于样品室和检测器之间的为发射单色器，筛选出特定的发射光谱。单色器上有进、出光两个狭缝，增大狭缝宽度则信号强度增强，减小狭缝宽度则分辨率增大。单色器的色散能力与杂散光水平是两个重要的性能指标，比较理想的单色器应具有低杂散光，以减少杂散光对荧光测量的干扰，同时具有高色散能力，以便弱的荧光也可以被检测到。现在某些型号的荧光分光光度计上采用了双光栅单色器，入射杂散光大大减少了，然而仪器的灵敏度却大幅降低。

四、样品室

样品室通常由石英池架(适于液体样品用)或固体样品架(适于粉末或片状样品)组成。测量液体样品时，光源与样品成直角安排；测量固体样品时，光源与样品成锐角安排。荧光仪上用的样品池与紫外可见分光光度计上用的样品池存在较大差异。紫外可见分光光度计上用的比色皿材质常为玻璃或石英，方形，两面透光；而测荧光用的样品池称为荧光池，是用石英材质制成，形状也为长方形或方形，但四面透光。低温荧光测定时还需在荧光池的外面再套一个充液氮的透明石英真空瓶。

五、检测器

检测器的作用是将光信号放大并转为电信号，一般用光电管或光电倍增管(PMT)作检测器。在一定条件下，PMT的电流量与入射光强度成正比，它测量的数据是众光子脉冲响应的平均值。加在PMT上的电压越高，则其放大作用越大。但是，过大的电压会造成PMT损坏，这点在实际使用中尤应注意。电荷耦合器件阵列检测器(CCD)是近年来出现的一类新型的光学多通道检测器，检测光谱范围宽、暗电流小、噪声低、灵敏度高，可获取彩色、三维图像。因其价格比较昂贵，常用在高档荧光仪上。

用PMT作检测器时，有两种不同的检测方式：荧光光子计数型检测与模拟型检测。

(1)光子计数型PMT光子计数型PMT适用于待测样品信号很弱、需取多次扫描平均值来提高信噪比的情况，其优点是具有较高的检测灵敏度和稳定性，对每个光子所引起的阳极脉冲都进行检测和计数，而且对施加于PMT上的高压电的电压波动不敏感，对放大器和高压电的电源稳定性没有要求。其缺点是不能通过改变PMT上的电压来提高它的增益；光子计数也仅限定于线性的计数速度内。

(2)模拟型PMT模拟型检测是取各个脉冲所贡献的平均值，脉冲是否同时到达则无关紧要。其优点是能通过改变PMT上的电压来提高它的增益，因此可在很大的信号强度范围内检测而不必考虑非线性响应。模拟型检测器要求放大器和高压电的电源都要相当稳定。

六、显示系统

显示系统由光度表、计算机操作系统等组成。

七、仪器工作过程

由光源发出的光经激发单色器变为单色光，照射在荧光池中的被测样品上产生荧光；物质产生的荧光被发射单色器色散为单色光，经光电倍增管转化为相应的电信号，再经放大器放大反馈到A／D转换单元，模拟电信号即转换成相应的数值，最后经显示器或打印机记录被测样品的谱图，此时记录的谱图即为发射光谱(emissionspectrum)，又称为荧光光谱。这就是荧光分光光度计的基本工作过程。

八、分类

分子荧光分光光度计按单色器划分为光栅单色器型与滤光片单色器型荧光分光光度计；按光学系统划分为单光束荧光分光光度计和双光束荧光分光光度计；按测量光谱的性质分为稳态荧光分光光度计与瞬态荧光分光光度计。现在的商品荧光分光光度计大多是单光束、光栅型仪器。