荧光原位杂交体植入的应用实验

荧光原位杂交体植入的应用实验
PBl、PB2 标本的制备

1.在 50 mL 培养瓶准备新鲜固定液（甲醇：冰乙酸=3:1)，在冰柜中保存备用。

2.将毛细吸管在小型喷灯的火焰上拉出内径约 50pm 的尖，内径太大可能会丢失极体。

3.加几滴固定液再处理预先处理过的玻片以清除可能存在的油脂或灰尘，用无尘纸吸干。

4.用巴斯德吸管吸少许 HPLC 纯水加到可悬挂液滴的载玻片上。

5.从卵母细胞或受精卵成功取出极体后，可以用相差显微镜（10X、20X 物镜）来观察极体，极体存在于显微操作仪上的平皿里的 20|uL 培养液滴里（液滴上面用矿物油覆盖)[6]。

6.极体定位好后，用拉好的毛细吸管吸取少量水，以确定液体进出吸管的通畅。

7.在吸入少量水后，将极体轻轻吸入毛细吸管移向有水的可悬挂液滴载玻片上，从毛细吸管中轻轻吹出释放极体，直到在玻片中心的圆圈中看到极体。勿让极体固定和贴到可悬挂液滴载玻片的玻璃表面。

8.在水中漂洗片刻后，用毛细吸管重新吸入极体。极体周围的油通常可以被水洗掉。将极体移向一张干净的载玻片，轻轻吹出含极体的水滴将极体释放。

9.当水分部分蒸发后，极体开始涨大，变扁平贴到玻片表面。在水分完全蒸发完之前用同一毛细吸管滴一滴固定液在极体上，使染色质分散开。

10.在固定液完全干掉前，再滴一滴固定液固定，必要时可重复几次，直到细胞质完全溶解，仔细注意观察此过程，应尽量将细胞质去除干净。

11.用金刚石笔在染色质周围画圈定位，注意不能太重，以免玻璃碎屑的影响，再用力在圆圈周围的玻片背面画另一圆圈，以便轻易找到圆圈和分析时定位染色质的位置。

12.将玻片做好标记，包括患者姓名、卵母细胞编号以及合适的信息，如染色质块数目。

13.再加数滴固定液到玻片上，用洗耳球吹干。

14.玻片可在室温放置后或立即进行杂交，如果立即杂交，则推荐进行预处理。可在移植胚胎比较合理的时间范围内得到很好的结果。

15.用不褪色标记笔在玻片的背面画出极体染色体质所在，以便确定加探针的位置。

荧光原位杂交体植入的应用实验，卵裂球标本的准备

1.在 50 mL 培养瓶准备新鲜固定液（甲醇：冰乙酸=3:1)，在冰柜中保存备用。

2.在一 35 mmX10mm 的有盖培养皿底部刻一圆圈便于在此区域找卵裂球，在皿内加 3 mL 低渗液。

3.将 25~50uL 毛细吸管在小型喷灯的火焰上拉出内径约 70um 的尖毛细吸管。

4.在毛细吸管吸入少量的低渗液。

5.在解剖显微镜下定位在培养液微滴内的卵裂球，再次确认制成的毛细吸管的内径比卵裂球大，可以用来吸取卵裂球；然后用它轻轻地吸取卵裂球，将卵裂球移到低渗液皿内。

6.低渗 3~5 min 后，将卵裂球吸到管内移到有少许低渗液的玻片上。

7.在倒置显微镜下持续观察卵裂球直到几乎全干。在低渗液全干形成结晶之前在卵裂球上滴上一滴固定液。持续观察细胞，在全干前滴一滴新固定液。如此重复几次，直到细胞质裂解，留下细胞核。细胞质去除是否完全直接影响杂交 (见注释 1)。

8.用金刚石笔标记卵裂球的位置以便于杂交后的定位。

9.在玻片的磨砂端注明合适的信息，再滴数滴固定液，用洗耳球吹干。

10.玻片可以进行预处理。在加探针前，用不褪色标记笔在玻片的背面标记卵裂球核的确切位置，以确定加探针的区域。