荧光定量PCR——qPCR的原理及应用

　　qPCR的英文全名是Real-timeQuantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。

　　上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增技术俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。如今PCR技术早已走出实验室，在遗传学鉴定和疾病诊断中发挥着巨大的作用，在越来越广阔的领域里焕发着新的活力。

　　终点PCR是最原始、最简单的PCR方法，如今仍在被我们广泛使用。使用者只能在PCR反应结束之后，通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。终点PCR本身是无法定量的，因为该反应产出的DNA量不一定能反映最初情况。举例来说，不同样品和序列的扩增效率是有差异的。

　　PCR的反应过程：

　　传统PCR电泳结果：

（图片来源于网络）

　　因此，研究者们克服了PCR定量分析的挑战——实时定量PCR（qPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针（比如TaqMan），人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。

　　在qPCR中使用插入性DNA染料，随着PCR循环的连续进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以使人们对反应中的DNA进行定量。利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中的每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

qPCR的特点

　　·灵敏度高

　　·特异性强

　　·全封闭PCR过程，无需后续处理

　　·及时反馈扩增过程，摒弃重点数据，更适用于定量

　　·定量范围宽，可达10个数量级，无需稀释样品

　　·可实现一管多检

　　·仪器自动分析，更快获得结果

　　qPCR的原理

　　·什么是Ct值？

　　PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

　　·Ct值的重现性

　　Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性。

　　简单来说，模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环次数越少，即Ct值越小；Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知拷贝数的标准品可做出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。

　　qPCR定量分析，有绝对定量和相对定量两种。

　　·绝对定量：精确计算初始反应的模板浓度（DNA/RNA）

　　——病毒DNA或RNA的拷贝数

　　——转基因的拷贝数

　　·相对定量：计算初始反应模板的相对含量

　　——差异表达分析

　　——芯片评估

　　——转基因生物的检测

　　——基因型检测

　　qPCR常用的荧光标记

　　·非特异性荧光标记

　　——SYBR Green I

　　——EvaGreen

　　——LC Green

　　·特异性荧光标记

　　——TaqMan

　　——Molecular Beacon

　　——Amplisensor

　　qPCR的应用

　　·基因扩增

　　·扩增特异性分析

　　·基因定量分析

　　·基因检测

　　·基因分型

　　·SNP分析

　　·RFLP多态性分析

　　·单/多基因表达研究

　　·高通量基因表达谱研究

　　目前qPCR技术广泛应用于生物医药食品等行业，运用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等。