荧光定量PCR染料法介绍

     荧光定量PCR仪负责监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数。从理论上说，每一个qPCR循环会使目标序列翻倍，因此人们可以在Ct值的基础上对样本进行定量。

        荧光定量PCR主要分为染料法和探针法两种。染料法一般采用DNA染料，这种方法不仅使用简单，成本也zui低。不过染料法检测的是体系中的所有双链DNA，不具有序列特异性。为此，一些厂商提供ROX作为内部荧光参考标准，用来校正背景。探针法与染料法的zui大区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列。此外，人们还可以利用不同探针，在一个体系中同时检测多种指标。

        成本低是染料法qPCR的一个主要优势，DNA染料相对比较便宜，而且适用于任何序列。不过染料法无法在同一个样本中检测多个指标，也难以鉴定扩增得到的序列，会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。在这种情况下，就需要进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。熔解曲线分析能够帮助研究者确定扩增的特异性。理论上利用熔解曲线也可以进行多染料的反应，甚至可以粗略定量那些峰值。

        探针法qPCR使用具有序列特异性的荧光寡核苷酸探针。目前zui常用的是TaqMan®探针，该探针5’端连有荧光基团，3’端连有淬灭基团。在反应进行时，探针与正反向引物之间的模板结合，当聚合酶到达探针处时，酶的5’-3’外切活性将荧光基团切下，使其脱离淬灭基团，发出荧光。