荧光显微术原理

在一百年前，斯托克（STOKES）发现自然界有许多物质能在较短波长光线照射下，发出较长波长的光线，也即这些物质在被紫外光、紫光、兰光或绿光照射后，能激发出兰色、绿色、黄色或红色的荧光，叫做光致荧光，于是在1911 年奥地利科学家K.Reichert*次制成有实用价值的荧光显微镜，采用碳弧灯作激发光源，用液体滤光器分离出所需紫外光，采用普通显微镜进行观察。

当时荧光显微术对植物学及矿物学利用初级荧光即可获得良好的分析效果，但对于人及动物的内科研究则不能采用，因为人及动物的初级荧光太弱。在1933 年，M.Haitinger 发现第二次荧光，把标本经过荧光染色处理后，再用短波光线激发，获得较强荧光以适应对人及动物的研究。免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题，由于抗原抗体反应的高度特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中一个因子，也就知道了另一个因子，用普通染料来使抗体（或抗原）着色，由于被视觉所能感知的染料分子的数量比较大，往往破坏了抗原或抗体的特异活性而不能达到目的。荧光染料它本身是作为一个发射体而显现颜色，可在黑暗背景下观察，对人的视觉有高度灵敏性，只需极微量光线就可在显微镜下被感知，这就使荧光染料成为一种合适的标记物，它既能使被标记的抗体保持原有的特异活性，又能在荧光显微镜下被肉眼觉察。
荧光标本制作过程是将抗原固定在玻片上，然后用荧光抗体（荧光染料与抗体相结合）染色一定时间，以水冲洗，如抗原抗体发生反应造成结合，则抗体固定在抗原上，否则被水冲去，zui后在荧光显微镜下观察结果。每一种细菌都有自己的特异抗原，因此，在原则上，应用充分的特异的荧光抗体，可以从血清学上鉴定任何一种细菌。由于荧光染色的色素只需极稀的浓度便能激发出明亮的荧光，一般对机体是无害的，因而为活体观察，如研究功能器官的过程和微细结构，某些代谢变化的过程等，提供了广泛的可能性，另外，荧光色素染色法非常简单，需时短，标本制作容易，特别适合于快速工作，如传染病的快速诊断等。