蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术取得新进展

　　3月8日，国际著名期刊《eLife》在线发表了北京协和医学院、北京生命科学研究所（NIBS）、北京大学和清华大学等处的一项最新成果，题为 “Trifunctional cross-linker for mapping protein-protein interaction networks and comparing protein conformational states”。在这项研究中，研究人员开发了一种赖氨酸靶向交联剂，以改进创新性的技术——蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis，CXMS）。

　　NIBS的董梦秋和雷晓光两位研 究员是本文共同通讯作者。董梦秋研究员早年毕业于四川大学，1995年硕士毕业于中科院上海生化所，2001年博士毕业于耶鲁大学，曾经在美国加州大学圣 地亚哥分校、斯克利普斯研究院从事博士后研究，2007年至今，北京生命科学研究所研究员。2012年，董梦秋实验室与贺思敏教授研究组合作，研发出了一 套完整的基于高精度质谱鉴定化学交联肽段的新技术方法，这一研究成果公布在Nature Methods杂志（NIBS董梦秋组发表Nature子刊文章；专访董梦秋：学科交融，思想交融的结晶）。 雷晓光研究员2001年毕业于北京大学化学系，2006年博士毕业于美国波士顿大学，曾在哥伦比亚大学从事博士后研究，2008年底全职回国，曾任天津大 学药物科学与技术学院药物化学系教授，博士生导师，北京生命科学研究所研究员。有多项研究成果发表在Nature，Cell，Nat.Chem. Biol.，Angew. Chem. Int. Ed.，J.Am. Chem. Soc.，Chem. Sci.和Cell Res.等国际顶级刊物上（NIBS沈志荣、雷晓光Cell子刊发表程序性坏死研究新成果；NIBS雷晓光实验室报道天然产物首次仿生全合成）。

　　在不同的复合物中，蛋白质通过与多个蛋白质合作伙伴相互作用，而执行不同的功能。研究蛋白质复合物结构和蛋白质间相互作用，对于理解它们的功能是至 关重要的。近年来，蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis，CXMS）已经成为分析这种结构和相互作用的有力工具。与传统方法相比，CXMS方法耗时少，对样品纯度要求不高；因此，这种技术受到 越来越多的欢迎。

　　随着分析仪器发展的最新进展，交联试剂和软件，已经使CXMS从默默无闻到日益突出，并涌现出一系列成功的应用案例。然而，CXMS仍受到样品复杂 性和交联肽低丰度的限制。为了降低大分子复合物包含的样本的复杂性，通常需要广泛的分馏。在更异质性的样本中（如天然免疫沉淀物和全细胞裂解液）确定交联 肽，甚至更为困难。

　　考虑到样品中交联肽的稀疏性，交联后使用亲和标记物将它们从复杂的混合物中纯化出来，将是有利的。然而，尽管研究人员加大了力度，开发具有富集功能的化学交联剂，但是只有很少一些药物已被证明能提高复杂样品的识别能力。

　　在这项工作中，研究人员开发了一系列的化学交联剂，它们具有一种之前首创的模块化设计。它们都包含一种用于亲和纯化的生物素标记物，和一个裂解位点 ——可用于将交联肽从链霉亲和素磁珠上释放出来。研究人员选择了具有最佳性能的交联剂，并开发了一种强大的富集程序，具有97%以上的浓缩效率。他们称之 为赖氨酸靶向富集交联剂（Leiker）。研究人员利用之前开发的pLink识别软件，表明用Leiker可有效地促进各种各样样本类型的CXMS分析，从纯化的复合物、天然免疫沉淀物，到高度复杂的全细胞裂解液。

　　交联剂修饰的肽的定量，有可能检测到蛋白质的构象变化和分子间相互作用的变化，虽然这些方法不是很成熟。为了解决这项技术的这个潜在关键应用，该研 究小组合成了稳定的同位素标记的Leiker。同时，他们构建了自动化数据分析流程，用于轻和重Leiker交联连接的相对定量。

　　作为一个概念验证，研究人员对一个RNA结合蛋白L7Ae，进行了定量CXMS分析。使用氘标记的Leiker，研究人员发现，正如预期的那样，在 存在RNA的情况下，包埋在RNA结合的三个L7Ae赖氨酸残基，它们的单一连接大幅度下降。研究人员进一步将量化CXMS的应用，延伸到了一个高度复杂 的系统，包含对数期和稳定期的大肠杆菌细胞，并鉴定了一个生长期特异性的蛋白质相互作用。