蛋白质定量技术――iTRAQ

摘要：同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，具有较好的定量效果、较高的重复性，并可对多达四种不同样本同时进行定量分析。研究人员采用iTRAQ蛋白质定量技术加速蛋白质的定量研究，当然这门新兴的工具仍然需要进一步的完善。
   

仅仅知道蛋白质的身份并不足以对蛋白质给出最终定论，因为蛋白质的浓度对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，一种特殊蛋白质在浓度上的变化，就能预示细胞的突变过程。因此，科学家能够对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量，是很重要的事情。过去，科学家通常先进行二维(2D)凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质。可是，这种方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精确。

新泽西医学及牙科大学的蛋白组学研究中心主任Hong Li说：“当我们开始蛋白组学研究时，就采用2D凝胶技术，但得出的信息量却让大伙很失望，因为许多蛋白质已经改变了自身的代谢过程，如热休克蛋白或者是管家蛋白。”   

蛋白组学中的方法一直在不断提高。基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。iTRAQ和iCAT是这些新进展中的两大主力，但是，新技术也有不尽如人意的地方，需要不断改进。
 
iTRAQ试剂盒包括四种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量。美国应用生物系统公司蛋白组学TOF-MS产品主任Dominic Gostick说：“试剂盒包含5步反应所需要的每一种物质。甚至包括胰岛素。”   

iTRAQ的操作程序一般如下。将蛋白质裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂进行差异标记。再将标记的样本相混合，这样就可以对其进行比较。与样本结合后，通常用MudPIT多维蛋白质鉴定技术进行下一步的操作，用2D液相色谱串联质谱进行分析。在质谱分析鉴定特殊肽离子片断结构的基础上，采用美国应用生物系统公司的软件包MASCOT和Protein Pilot对每一个肽段进行鉴定。

iTRAQ的发明者Darryl Pappin博士表示，水解之后，每一个蛋白质会产生大量的肽段。用四种iTRAQ试剂对每一个肽段进行标记，每一种都被看作是独立的测量，所有的测试都是均匀的。但是，有一些蛋白质也许只进行一次肽测定，对哪些肽继续进行研究最终是由研究人员决定的。

iTRAQ鉴定

iTRAQ定量

有用工具
   

Li认为iTRAQ的试验过程非常简单，因为化学标记工作很完善。对于定量工作而言，标记的效果很重要，而且，iTRAQ的定量工作是可重复的。因为如果一个定量方法不能重复，它就没有意义。   

英国谢菲尔德大学的Phillip Wright博士认为技术的可靠性和可重复性能都很好，iTRAQ的精确性能好于其他的工具，获得的变异系数在9％的范围。

为了调查变异系数，研究人员用其他方法对iTRAQ结果进行了验证。加州大学的Jan Hirsch博士在两个不同的试验中，用酶联免疫吸附试验(ELISA)对iTRAQ进行了验证。他指出，ELISA验证方法有自己的缺陷，它可能无法检测到质谱检测到的所有肽段，或者质谱仪可能将额外的肽段分配到蛋白质中。

iTRAQ比以前的技术更具优势。Hirsch相信iTRAQ是定量蛋白组学研究中一种非常好的方法，但他认为还需要进一步改善。iCAT和iTRAQ技术的缺陷在于，它们只提供相对的定量。因此，只能对相对丰度进行比较。也就是说，研究人员可以比较两组不同的样品，但对一个个体蛋白质的浓度而言，他们只是获得了一个相对值。标准化的对照可以帮助定量结果，但是常常只提供一个或一对蛋白质的信息。总之，同位素质谱方法能提供有价值的信息，例如可以对经过不同处理后的动物细胞裂解液样本进行比较。
 
Harbor-UCLA医学中心的Beerelli Seshi博士说：“因为我们对定量比较感兴趣，所以iTRAQ更适合我们，因为它可以同时对四个样品进行比较。不但可以定量，而且也能进行鉴定。”   

iTRAQ比其他的蛋白质定量方法更敏感。Li说：“采用iTRAQ技术，我们观察到大量的蛋白质变化情况，而这些变化以前是看不到的。”这是2D凝胶电泳存在的问题之一，因为它的分辨率和低敏感性。观察低丰度蛋白质中的变化需要高敏感性能。

当然，作为全球通用的蛋白组学方法，它应该是客观的。Seshi就表示对研究结果没有倾向性。他采用iTRAQ对体外生长的白血病患者骨髓间质细胞和正常骨髓间质细胞的蛋白质组进行标志，他希望能深入研究“骨髓微环境在白血病的发育过程的影响”这一内容。而且，因为癌症是一种多基因疾病，一次能同时对多种蛋白质进行研究就显得很重要。所以，需要强大的蛋白组学方法。

iTRAQ的另外一大优点是，它可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质，酸性蛋白质和碱性蛋白质，2D凝胶电泳对这些蛋白质都束手无策。而且，2D凝胶电泳无法对膜蛋白那样的不溶性蛋白质进行分析，但是iTRAQ标记系统和质谱法联合使用可解决这些问题。

不断改进
   

蛋白组学研究产生了大量数据。Seshi认为数据太大了，因此需要解决数据挖掘问题，使用合理方法去分析数据。他说：“数据输出信息并不包括蛋白质的基本信息，如分子量和等电点，为了获得这些信息，我必须一遍又一遍进行处理，这些参数都可以通过2D凝胶电泳获得，但是iTRAQ标记和串联质谱分析获得的信息要丰富得多。”   

Seshi认为这些丰富度使得数据的复杂度更高，尤其是研究全蛋白组时。在他看来，蛋白组学技术的缺点之一是，他们不适合于全体蛋白组学，因为高丰度蛋白质干涉了低丰度蛋白质的检测和鉴定。   

Wright表示，将大量的蛋白组学数据相混杂是与鸟枪型处理（如iTRAQ）有关的另一个问题：每次试验，研究人员都必须鉴别全部的蛋白质组。而2D凝胶电泳方法，运行一次凝胶电泳，就执行一次成像分析，然后只选择一个蛋白质点进行质谱分析。2D凝胶电泳不能绘制整个蛋白质组，但是能观察到差异变化。   

iTRAQ不仅用于标记全蛋白质组，也用于亚细胞蛋白质组（如细胞器和膜内部蛋白质）的标记。英国Sainsbury 实验室的首席科学家Alexandra Jones博士将iTRAQ与磷酸浓缩肽结合使用，设法鉴定Arabidopsis的磷蛋白质组，以及血浆薄膜的蛋白质组信息，她首先用iTRAQ对其进行标记。她表示，浓缩过程非常复杂，涉及到许多步骤，但是一旦提早对蛋白质组进行标记，随后无论进行多少操作都变得很简单。

虽然有一些缺陷，但iTRAQ仍然是蛋白组学研究的一个有力工具。继续对其可用性能进行改善，并且使技术规范化，iTRAQ一定会成为蛋白组学研究中的强大武器。

（译自《Genomics & Proteomics》）