蛋白质工程技术助力探索离子通道激活机制

　　近日，北京师范大学王友军课题组及美国德克萨斯州A&M大学Yubin Zhou课题组采用蛋白质工程技术，巧妙地实现了膜蛋白在亚细胞器和质膜之间定位的切换，为研究细胞器膜蛋白的结构和功能提供了更加便捷的手段和新的思路。基于此方法，本文的一作郑思思、马国林、何涟“驱使”内质网定位蛋白STIM(Stromal interaction molecule)转位到质膜上，并进一步鉴定出了STIM蛋白上的一个关键位点，实现了STIM 同源蛋白STIM1和STIM2之间功能的“一键”（单点突变）互换，从而阐明了STIM1和STIM2不同的分子特性及激活机制。该研究成果“Identification of molecular determinants that govern distinct STIM2 activation dynamics”以长文形式发表于PLOS Biology。

　　钙库操纵的钙内流(Store-operated Ca2+ entry, SOCE) 是动物细胞内普遍存在的一种钙信号产生和钙稳态维持机制，SOCE异常与免疫系统、癌症、心血管疾病及神经退行性疾病等密切相关。SOCE是由内质网上的STIM蛋白和质膜上ORAI 钙离子通道蛋白所共同介导的，因此揭示STIM激活和调控机制有着非常重要的意义。

　　内质网腔内钙离子浓度降低所导致的Ca2+从STIM钙结合功能域（EF-SAM）的解离，是SOCE激活的最初事件。因而对内质网钙感受器STIM蛋白钙亲和力的准确测定，是阐明其激活分子机制的关键。但由于STIM EF-SAM 区域位于难于测量和操纵的内质网腔内，十多年来领域内对STIM1和STIM2的钙亲和力大小一直有争议。

　　王友军与Yubin Zhou两个课题组协同合作，利用蛋白质工程技术将原本内质网定位的STIM蛋白翻转移位到了质膜上，STIM依然保持了相应Ca2+感应的功能，但是其EF-SAM区从难以操纵的内质网腔内转移到可以方便而精准调控钙浓度的细胞外。运用这一原创的质膜定位的STIM，结合两个课题组之前发展的FRET纳米探针原位实时监测STIM激活的技术[1]，研究者得以准确测定STIM蛋白在质膜上时的钙亲和力。结果表明STIM1 和STIM2的钙亲和力都比之前报道的偏低，暗示内质网腔内可能存在未知的调控STIM的细胞因子，从而为后续研究指出新的方向。

　　SOCE激活的关键是STIM EF-SAM区在脱去Ca2+后，通过进一步的构象变化将内质网钙水平降低的信息跨膜传导至胞浆。本文作者利用原创的纳米探针，揭示了STIM蛋白是如何将内质网内的信号经过STIM跨膜区域传导至胞浆区域、打破胞浆区域的自我抑制, 而使结合ORAI 的区域 (SOAR) 暴露出来[1]。SOAR 区会介导STIM1多聚，进而桥连内质网和质膜。基于上述纳米工具，研究者对合作发现的一个新内质网膜蛋白STIMATE进行了、研究，揭示了其辅助STIM1激活的分子机制[2]。SOCE的产生最终需要STIM胞浆部分的SOAR结合，并打开质膜上的Orai1钙离子通道。

　　虽然之前的工作[3]表明STIM2胞浆区结合并激活Orai1的能力远较STIM1弱，但相关分子机制并不清楚。本研究运用蛋白质工程技术所合成的一系列SOAR1-SOAR2嵌合体，鉴定出了决定SOAR1 和SOAR2差异性结合（PLOS Biology, 2018）及激活[4] ORAI1的关键位点， 从而阐明了SOCE被STIM特异性激活的关键分子机制。

　　这一系列工作不仅系统地回答了SOCE调控及激活中的一些关键问题，还为治疗SOCE相关疾病提供一些新的思路。本研究受自然科学基金面上项目NSFC-31471279和NSFC-31671492、青年千人计划、北京师范大学自主科研基金资助项目2017STUD20和2017EYT21的资助。

　　1. Ma G., et al., Inside-out Ca(2+) signalling prompted by STIM1 conformational switch. Nat Commun, 2015. 6: p. 7826.

　　2. Jing J., et al., Proteomic mapping of ER-PM junctions identifies STIMATE as a regulator of Ca(2)(+) influx. Nat Cell Biol, 2015. 17(10): p. 1339-47.

　　3. Wang Y., et al., STIM protein coupling in the activation of Orai channels. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(18): p. 7391-6.

　　4. Wang X., et al., Distinct Orai-coupling domains in STIM1 and STIM2 define the Orai-activating site. Nat Commun, 2014. 5: p. 3183.