蛋白质磷酸化的测定实验—代谢标记

细胞

培养瓶

1. 用 60 mm 或 100 mm 培养瓶，在完全培养基中培养细胞至所希望的密度。

2. 用预热的低磷酸培养基（无放射性磷酸盐）冲洗两次，然后加入含 0.5~1 mCi³²P/ml 的低磷酸培养基（50~100 μmol/L 无机磷酸）。

3. 培养结束后，回收 ³²P 标记培养基，用 10 ml Aquasol (NewEnglandNuclear) 或 Ecolume(ICNBiomedicak) 稀释，取一等份用液闪计数器测定 ³²P 活性。测定培养基中磷酸浓度 （Sanui 1974）（可以用无 ³²P 的低磷酸培养基)。从这两个数据计算标记培养基 中 ³²P 比活 。

4. 无二价离子的 PBS 清洗 ³²P 标记的细胞两次。每个 100 mm 培养皿加 1 ml 预热的裂解缓冲液在沸水浴中裂解细胞。用一次性细胞刮刷将细胞裂解物刮到一边，然后吸到 1.5 ml 离心管，热水浴 10 分钟。

5. 冷却至室温。由于 DNA 的舒展，裂解物变得很黏稠。

6. 留上清，加 NP40 至 2%，加 MgCl₂ 至 5 mmol/L ( 都用母液）。加无蛋白酶的 DNA 酶Ⅰ与 RNA 酶各 0.1 mg，室温放置 20 分钟。