蛋白质紫外分光测定实验

标准蛋白溶液 待测蛋白溶液

一、试剂

1．标准蛋白溶液

准确称取经微量凯氏定氮法校正过的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/ml的溶液。

2．待测蛋白溶液

配制成浓度约为1mg/ml的溶液

二、操作

1．标准曲线的绘制

按下表分别向没支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。


2．样品测定

取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测蛋白质的浓度。

三、其他方法

1. 将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质浓度。

计算

蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260

式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。

此外，也可先计算出A280/A260的比值后，从下表查出校正因子F值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将F值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。

蛋白质浓度（mg/ml）=F×1/d×A280×N

式中A280为该溶液在280nm下测得得光吸收度值，d为石英比色杯得厚度（cm），N为溶液得稀释倍数。

紫外吸收法测定蛋白质含量得校正因子


2. 对于稀蛋白质溶液，还可用215nm和255nm的吸收差来测定浓度。从吸收差△Ａ与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。

吸收差△Ａ＝Ａ215－Ａ225

式中的A215和A225分别式蛋白质溶液在215nm和225nm波长测得的光吸收值。

此法在蛋白质含量达20-100μg/ml的范围内，是服从Beer定律的。氯化钠、硫酸铵以及1×10-1mol/l磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是1×10-1mol/l乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5×10-3mol/l才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收峰常因pH的改变而有变化，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线测定的pH一致。

3. 如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值[A1%1cm]，则取该蛋白质溶液于280nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。