蛋白酶的测定实验

实验方法原理

血红蛋白不是很贵，被用来做这个实验。由于处于天然结构的蛋白质通常可以抵制蛋白酶的攻击，因此首先用尿素使血红蛋白失活。分离非水解蛋白质后，利用 Folin-Ciocaheau 试剂的上清液测量消化产物。这种试剂优先识别色氨酸和酪氨酸，但是也可以识别半胱氨酸和组氨酸。'

实验温度取决于酶的专一性，为了稳定酶的活性，温度可从室温（25℃）变化到 50℃。

实验材料 酶样品

试剂、试剂盒 KH2PO4三氯乙酸Folin-Ciocaheau 苯酚试剂HClL-酪氨酸血红蛋白底物

仪器、耗材 分光光度计

实验步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

1. 样品液及空白对照的处理：

2. 校准曲线

准备 0～250 nmol L-酪氨酸的校准曲线。用 0.2 mol/L HCl 补充 0.2 mol/L L-酪氨酸（1 ul～1 nmol）的递增量（约 12 种不同的样品）直到 0.5 ml，并向每个样品中加入 1 ml 0.5 mol/L NaOH 和 0.250 ml Folin-Ciocalteau 苯酚试剂（1：2 稀释）。测量 750 nm 处对于空白对照（无酪氨酸）的吸收值变化，得到关于酪氨酸浓度增加与吸收值增加的线性曲线，直线的斜率＝吸收值/nmol Tyr。

3. 计算

由于很难测定从血红素得到的摩尔产物，因此定义特别的 Anson 单位如下：1 AU 指在实验条件下，1 min 产生相当于千分之一的酪氨酸（1 nmol 酪氨酸约 1AU）所产生的着色强度的酶量。

校准曲线斜率除以 750 nm 处的吸收值等于得到产物量，与 nmol Tyr成正比。要得到 uAU，这个值必须被培养时间除（min）并且乘以因子 3，这是因为只有总实验量 1.5 ml 中的 0.5 ml 被用来显色反应，并且这也是可能的稀释因子。

实验中的酶的活力：

对于整个酶溶液，得到的这个值必须乘以整个酶溶液的量，并被实验用的酶量和转化 AU 的因子除。

总的酶活性：

注意事项

其他

试剂：

1 mol/L NaOH（Mr＝40.0；4 g NaOH 溶于 100 ml H2O，储存于 PE 管中）

0.5 mol/L NaOH（1：1 的 1 mol/L NaOH 和 H2O）

1 mol/L KH2PO4（Mr＝136.1；13.61 g 溶于 100 ml H2O 中）

0.3 mol/L 三氯乙酸（Mr＝163.4；4.9 g 溶于 H2O 中）

Folin-Ciocaheau 苯酚试剂（可购买到，储存于 4℃；使用前用两倍的水稀释）

0.2 mol/L HCl［用H2O 将 3.31 ml HCl（37％）200 ml］

1 mmol/L L-酪氨酸（Mr＝181；18.1 mg 溶于 100 ml 0.2 mol/L HCl）

血红蛋白底物：用 100 ml 的烧杯盛入 10 ml 的水，必须水浴，使温度保持在 25℃。以下的组分，一边搅拌一边逐一加入 11.54 g 尿素、2.4 g 1 mol/L NaOH、0.635 g 冷冻的血红素

搅拌 45 min 后，3.156 g 1 mol/L KH2PO4 溶解。加入水，使总重 32.6 g，并用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.5。溶液应该在低温（5℃）储存，并在 14 天内使用。对于每一种新制备的血红素底物，使用不同的标准曲线。