血浆清蛋白的分离纯化与鉴定

实验概要

1．掌握蛋白质的分离技术

2．掌握分段盐析、凝胶层析及蛋白质醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方法

3．掌握电泳方法检测分离效果

实验原理

          不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。利用硫酸铵分段盐析法将血清中的清蛋白及球蛋白分离，清蛋白液再利用葡聚糖凝胶过滤法除盐，即可得到较纯的清蛋白。纯化后的清蛋白可利用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。          盐析：是指将中性盐（如硫酸铵）加入蛋白质溶液中，中和Pr蛋白质表面电荷及破坏水化膜，使蛋白质相互聚集在析出。分段盐析：各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和PH不同，利用不同盐浓度下Pr溶解度不同，将蛋白质分段沉淀下来。半饱和硫酸铵沉淀血清中球蛋白（清蛋白溶解）将血清清蛋白和球蛋白初步分离。          常用的除盐方法：半透膜透析；凝胶过滤（层析）。在葡聚糖凝胶层析柱中，由于蛋白质和盐的分子量不同，洗脱速度也不同，大分子蛋白质不能进入凝胶的网孔内而先流出，小分子盐则可进入网孔滞留在凝胶内，收集蛋白洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。用三氯醋酸液鉴定洗脱的蛋白液，以BaCL₂检测硫酸铵。         纯化后的清蛋白用醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果。

主要试剂

1．饱和硫酸溶液：称固体硫酸铵85g于100ml蒸馏水中，在70～80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调PH为7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上
      层液即为饱和硫酸铵液。
2．生理盐水：称取分析纯NaCl 0.89克，蒸馏水稀释至1000ml.
3．葡聚糖凝胶Sephadex G-25: 称取10克Sephadex G-25，加入200ml 0.02mol/lPH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。

4．10％三氯醋酸。
5．1％氯化钡溶液

6．pH8.6，离子强度0.06巴比妥电极缓冲液：称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml。
7．氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5g，用甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml溶解。
8．漂洗液：95％乙醇45ml，加冰醋酸5ml及蒸馏水50ml。

主要设备

1．电泳仪、电泳槽
2．电动离心机、层析柱
3．镊子、培养皿、X光软片、滤纸
4．离心管、烧杯、量筒、滴管、小试管、吸管

实验步骤

1．盐析沉淀血清球蛋白

        取离心管1支，加入盐析用蛋白质溶液3ml（血浆1ml和生理盐水2ml），再逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵液3.0ml，充分摇匀。静置20分钟后离心（3000rpm×10分），取上清液（此液中主要含清蛋白）备用。

2．凝胶层析脱盐 

      （1）装柱：取层析柱（1×500px）,关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加已膨胀的葡聚糖凝胶G-25悬液，至凝胶沉淀10～375px高，注意凝胶床表面应平整。

       （2）上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面，关紧下端出口。取1ml上清液（清蛋白液），小心缓慢地加到凝胶床表面上，注意不要破坏凝胶床表面的平整。打开下端出口，使样品进入凝胶床，小心加入少许蒸馏水于柱内，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后可加入多量的蒸馏水进行洗脱。流速为20滴/分。

      （3）收集：事先应准备好15支小试管，于加样后开始立即收集洗脱液。每收集约1ml换一管。 检查：按洗脱液的管号顺序每管取出一半，各加10％三氯醋酸5滴，出现白色混浊或沉淀者即有蛋白质存在；取对应沉淀最多的收集管溶液用着电泳鉴定。

      （4） 继续用蒸馏水洗柱，流出液用1%BaCl液检测，直至无白色沉淀出现后，洗柱完毕，关闭出口。

3．醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果

      （1）取2×200px大小的醋酸纤维薄膜2张，于巴比妥缓冲液中充分浸湿。将浸湿的膜条取出后用滤纸吸去多余的水分，于无光泽面点样。 

      （2）在距离膜条一端约37.5px处，用X光软片蘸取全血清和纯化的清蛋白样品液分别点于两张膜条上。 

      （3）将巴比妥电极缓冲液加于电泳槽内，再将点样后的膜条放置于电泳槽架上，槽架上用四层滤纸作桥垫。放置时膜条的无光泽面应向下，点样端置于阴极，膜条与滤纸面贴紧。

      （4）接通电源，以150V恒压电泳约45分钟。

      （5）通电完毕后，用镊子将膜条取出，浸于盛有氨基黑10B的染色液中染色液中，染色5～10分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干膜条，观察电泳图谱中蛋白质区带，并与全血清蛋白质的电泳图谱作比较。