血液中的宝藏：细胞外RNA

　　血液是唯一与所有器官都有接触的组织，携带着有关机体的大量宝贵信息。在理论上，检测血液携带的 DNA、RNA、囊泡和细胞残骸可以帮助人们诊断和监控各种疾病。产前基因筛查是血液检测的一个重要应用，不过其他循环生物学指标正在受到越来越多地关注，比如甲基化、RNA、微囊泡和外泌体。为了帮助大家更好的分析甲基化、分离囊泡、提取RNA、存储样本和分析数据，The Scientist杂志最近与多位专家学者探讨了检测不同血液生物学指标的策略，贡献出了相应的注意事项和实验技巧。

　　上接：血液中的宝藏：外泌体microRNA

　　研究者：加州大学圣地亚哥分校副教授Louise Laurent，美国转化基因组研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

　　研究项目：鉴定胎盘功能障碍（Laurent）和大脑损伤（Keuren-Jensen）的循环miRNA指标

　　研究背景：近年来，人们在血浆或血清样本中成功检测到了疾病相关的RNA（exRNA）。这些细胞外RNA可以成为非侵入性的疾病诊断指标，这是RNA检测最有前景的发展方向之一。在多种细胞受到破坏的疾病中（比如大脑损伤），循环miRNA是非常重要的生物学指标。研究这些miRNA的团队很多，可供选择的实验方案也不少，不过研究者们还没有就此达成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美国NIH细胞外RNA交流协会的成员，他们正在努力推动循环miRNA检测的标准化，提升细胞外RNA研究的可重复性。

　　胎盘囊泡：在妊娠期间，胎盘会将包含RNA的囊泡释放到母体血液中。Laurent希望从中鉴定胎盘疾病的miRNA指标，比如子痫前期和宫内生长受限。她和同事正在优化自己开发的方法，从外泌体和微囊泡提取miRNA并分析相关数据。初步研究结果显示，母体血液中的外泌体和微囊泡都可以分离出妊娠特异性miRNA。妊娠后期的miRNA指标与胎盘组织的关系尤为密切。

　　大脑撞击：Van Keuren-Jensen团队将监控撞击数据的感应器装在橄榄球运动员的头盔中，并在橄榄球赛季中收集运动员的血液、尿液和唾液样本。他们对这些样本进行RNA测序，寻找与撞击数据有关的生物学指标。研究人员使用了一系列商业化试剂盒，并且对细胞外RNA收集方法进行了比较。“使用不同的试剂盒或分离方法会造成很大的差异，”Van Keuren-Jensen说。“现在还很难断言哪种试剂盒最好。”

　　注意事项：有些测序试剂盒使用带“粘性”末端的短片段DNA来结合要扩增的目标分子。这些末端（被称为接头）可能给实验结果带来很大的变数。有些试剂盒产生的接头二聚体比较少，但测序偏好比较大。有些试剂盒提供的接头更随机化，可能与某些miRNA结合得更好。“这些因素会使结果产生较大差异，导致难以重复的结果，”Van Keuren-Jensen说。

　　实验技巧：Laurent指出，减少样本批次、尽量由同一个人操作有助于降低结果的差异性。使用内参（比如不受疾病影响的一种RNA）是提高结果可重复性得另一条途径。在没有一个通用标准的情况下，“设立内参可以帮你去除产量或批次差异带来的许多影响，”Laurent说。Van Keuren-Jensen建议大家在论文中分享自己所用的试剂盒和分离方法，因为这些信息对实验结果的重复很有帮助。

　　监控exRNA只需要采集血样，不像肿瘤活检那么有风险，成本也比较低。不过从血浆或血清中分离exRNA仍有一定的挑战性，一方面是因为exRNA丰度低，另一方面是因为血液中的污染物会抑制PCR。商品化的试剂盒能简化和加速exRNA提取过程，已成为循环exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人横向评估这些试剂盒的提取效率如何，是否能去除血浆中的污染物，是否会偏向特定的RNA。而这类评估对于结果解释和实验之间的比较都很关键。

　　于是，美国爱因斯坦医学院的研究人员评估了市场上7种常用的exRNA提取试剂盒，分别来自贝克曼•库尔特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他们具体评估了合成RNA的总体回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA产量和纯度，以及纯化后的扩增效率。研究结果发表在《BioTechniques》杂志上。（更多详细信息参见：细胞外RNA提取试剂盒究竟哪家强？）

　　早期非小细胞肺癌（NSCLC）是无症状的，并且很难检测到，因为目前没有可用的NSCLC血液测试。最近，在Cell子刊《EBioMedicine》发表的一项研究中，南京大学生命科学学院的张辰宇教授和南京大学附属金陵医院的张春妮教授带领的研究小组，确定了一组（五个）血清microRNA（miRNA），作为NSCLC诊断的潜在生物标志物。