血细胞分析仪的溯源及国际参考方法

为加强对血细胞分析仪的溯源及国际参考方法了解,作者主要对血细胞计数分析(红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白以及红细胞压积) 的国际参考方法建立的过程和及其概要进行了阐述,并对国际参考方法与各实验室目前方法学的溯源性进行了论述。在具体工作流程上,对使用人新鲜血或经过了稳定固化加工的血细胞确立检验结果溯源性方法及其注意事项进行了介绍,同时论述了室间质控和室内质控的重要性。

    1. 血细胞分析和国际血液学标准化委员会的历史: 血细胞计数是临床检查中最基本最重要的项目,检测内容包括红细胞,白细胞和血小板等血细胞计数项目以及血红蛋白浓度的测定。血细胞计数最初是使用显微镜对显微镜视野内的各种细胞以人工目视的方法进行计数, 但是, 1953 年Coulter 公司的创始人,W1H1Cloulter 成功的研制出世界第一台自动“流体中悬浮颗粒分析仪”之后,经过不断的技术革新,其自动化技术逐步应用于血细胞分析仪中。另外,作为一种简便的检测血液中红细胞浓度的方法,可将全血放入试管中,经过离心分离后测量沉淀的红细胞体积与样品体积的比例,即所谓的红细胞压积(Packed Cell Volume ,PVC) 。

    现在,红细胞压积的检测也已经成为自动血细胞分析仪的检测指标之一。红细胞中的血红蛋白具有输送氧气功能,其定量检测最初使用试管进行检测的,现在该方法也已经实现自动化,已成为自动血细胞分析的指标之一。这类可实现血细胞分析自动化的装置通常被称之为血细胞分析仪或HematologyAnalyzer ,最初在欧洲和北美被迅速普及。1963 年,在欧洲血液学会里斯本会议(葡萄牙) 上,召开了题为“血细胞分析技术及其标准化”的研讨会,大家发现,被认为是比显微镜检查准确度高的各种自动血细胞分析仪的检测结果大相径庭(室间差异) ,为了解决这个问题,大会设立了国际血液学标准化委员会( International Council for Standardization inHaematology) 。其中的血红蛋白检测专家组和血液细胞分析专家组一直在展开各种活动,致力于确立血红蛋白检测的国际参考方法和血液细胞分析的国际参考方法。2002 年末,血细胞分析的基本指标红细胞、白细胞、血小板分析及血红蛋白浓度以及PCV 检测的国际参考方法都已确立。

    2. 血细胞分析(红细胞、白细胞、血小板) 国际参考方法概略:红细胞和白细胞的国际参考方法制定于1994 年。检测系统中的所有血液流路部分都采用加工后多年不会变形的石英玻璃部件,定量部使用水银压力计。为了最大程度减少流体检测中的误差,设计尽可能简单,检测原理为电阻法。根据检验原理,需要对全血样品进行数万倍的稀释,为了最大程度减少稀释过程中的误差,要使用A 级的精密烧瓶和精密吸管。仪器对同时通过检测部位的细胞不具有修正功能,但可对一系列不同稀释比例的标本进行校准。利用不同浓度的标本同时通过检测部位的细胞数的比例不同的原理,以连续稀释的检测结果计算出无限稀释倍率浓度时的检测结果(在该浓度下,可认为没有细胞同时通过检测部) ,并将该结果确定为所测标本的“真值”。血小板的国际参考方法于2001 年确定。在此之前曾对各种方法经过长期的讨论,由于各种方法各有优劣都没有得到通过,新的参考方法是采用流式细胞术以单克隆抗体(CD41 和CD61) 对全血进行识别,得到红细胞总数和血小板总数的比率。再根据血小板和红细胞的比率,乘以红细胞参考方法所检测得到的红细胞真值来间接计算出血小板的真值。

    3. 血红蛋白的定量和PCV 国际参考方法简介:血红蛋白的定量是血细胞分析项目之中最早确立国际参考方法的指标,随后又进行过多次改定。检测时使用商品化的分光光度计,采用氰化高铁血红蛋白法进行检测。检测结果的准确度除了取决于分光光度计的质量,还有赖于检测所用的石英比色杯的精度,标本的稀释精度,以及是否根据参考方法中的规定对试剂进行调整,是否按照规定使用清洁的过滤网对标本进行测试前的过滤等。在过去,实验室中一直以精密毛细管法作为PCV 的参考方法 ,但是由于精密毛细管的一端需要封入黏土(seal) ,而且精密毛细管中血液各组分的交界部分不清晰或不均一,造成红细胞的沉积部分越到下方越容易因为压缩过度而脱水变形,越往上越容易混入白细胞,血小板或血浆( trappedplasma) ,所以,人们一直在探讨可以代替精密毛细管法的新方法,2001 年新的参考方法确立了。该法同精密毛细管法相比,从开始操作开始到往精密毛细管内吸入红细胞的步骤是相同的,但是计算时却慎重地避开了精密毛细管的上部和下部仅取中央部分,通过国际参考方法测定该部位的血红蛋白浓度。其结果与国际参考方法测得的全血的血红蛋白浓度的比率为PCV。