血细胞的分离方法1

血细胞由红细胞,白细胞,血小板等组成.实验中常用白细胞来做研究,如炎症渗出,细胞迁移,识别等都涉及到白细胞.白细胞又分为:粒细胞,淋巴细胞,单核细胞等.它们具有不同的功能.实验中常需要分离血细胞方能进行。

这里主要论述人外周白细胞的分离，主要是中性粒细胞（Neutrophil），淋巴细胞（Lymphocyte），单核细胞（Monocyte）的分离。其它骨髓，脾淋巴细胞等分离可参，不同种属间请注意分离液的选择。

细胞分离中需要注意的几个问题

1.如果您要做细胞培养，记住实验中所用的试剂（分离液，洗涤液等）、器械等都要是无菌消毒的，并注意实验中的无菌操作。

2. 离心转速单位及时间：目前国外的文献报道基本上用g为单位，注意g和转速（rpm）的换算。

3.离心温度：有的要求室温，有的要求4摄氏度。实验的操作要求尽可能熟练，连贯。

4.在用Ficoll分离单个核细胞（PBMC）时，通常含有少量的红细胞，对于一般的实验影响不大，如果实验要求较高，可采取裂解液（有的需要无菌），并注意裂解时间控制，以免影响单个核细胞的活性。

5. 在用Percoll配不连续梯度时（一般用高渗NaCl），注意各成份体积的准确性，否则密度与预期的不一样，影响分离效果。

6.用全血离心效果比全血稀释后再离心效果差，稀释一般等体积稀释一倍。

7.分离液与样本的体积比：一般应小于1：2（即一般为1体积分离液，2体积样本，不宜超过2体积，小于2体积均可）

8.洗涤液的成分：不同文献报道不一，有的使用PBS，有的为Hank’s，KRP等，可自己选定。主要是离子浓度及成份的不同，有的含有 Mg2+,Ca2+。

9. 细胞活性：0.2%台盼蓝染色3－5分钟，镜下观察计数死亡细胞（蓝染）。

中性粒细胞分离的方法

1、标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法

1）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。

2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma, PPP）。

3）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。

5）沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。

6）悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。

7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155M　NH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用HBSA（含钙）重悬。

8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。
2、不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法

1）先制备Percoll储存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的体积比为9：1。

2）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。

3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma, PPP）。

4）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

5）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。

6）沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬

7）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min.

8）单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间，中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间。血小板可通过 25%Percoll离心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除。

9）中性粒细胞层用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸缓冲液（KRPD，PH7.23）洗1次。

10）用这种方法可得80%中性粒细胞，纯度在95%以上。

3、“无LPS”方法（LPS-Free method)

1）已有用变形细胞（如白细胞）裂解的方法表明，容器及溶液的不含LPS，也就是说，LPS的含量小于 0.1ng/ml。

2) 无菌采集静脉血，用10%柠檬酸钠抗凝。

3）抗凝血中加入6%的Dextran(mol wt 70,000)，比例为3：1（vol/vol,blood/dextran），室温，1小时。

4) 收集白细胞的血浆，离心，去上清。

5）红细胞用低渗的0.2%NaCl裂解15秒（此步也可用0.155M　NH4Cl　15秒代替）

6）离心前立即加入10ml 1.6%NaCl（含糖(dextrose) 2mg/ml）

7) 离心后用KRPD洗2次。

8）此法得到中性细胞数与方法2类似，但纯度只有80-85%，余下为淋巴细胞及单核细胞。

8）此法得到中性细胞数与方法2类似，但纯度只有80-85%，余下为淋巴细胞及单核细胞