行稳致远|ZenoTOF7600系统稳定实现大队列定量蛋白质组分析

概述

本技术文档¹展示了ZenoTOF 7600系统扩展微升流速应用于蛋白质组学分析的性能和稳健性。该系统除常规调谐和校准外，连续运行28周，期间未对仪器进行清洗和维护。在连续运行的前21周时间内，通过定期质量控制(QC)测试来评估系统稳健性，使用Zeno SWATH DIA方法分析5 ng和50 ng人K562样本，以评估定量蛋白质组学性能。评估包括在第24-28周进行加速稳健性测试，>1,000次样本采集 (每一针进样量为0.5-1 ng)和 >1020 µg K562样本分析，来模拟高通量蛋白质组学研究。在28周内分析了超过1200µg蛋白质酶解产物。QC结果表明，在21周的测试期内，系统性能保持稳定，鉴定和定量的蛋白质和前体离子变异系数(CV) <20%保持稳定。该数据表明，ZenoTOF 7600系统非常适合应用于高通量研究和大样本队列分析，这对系统生物学和生物标志物发现工作具有重要意义。

ZenoTOF 7600系统

稳健性评估的主要特点

1、ZenoTOF 7600系统连续运行28周，系统分析蛋白质酶解产物总进样量 > 1200 µg

2、连续21周，1000次QC样本分析，鉴定和定量的蛋白质和前体离子重现性良好 (CVs < 20%)

3、QC样本测试期间，监测的肽段展现出一致的峰面积，肽段峰面积CV < 20%

图1. 21周仪器测试周期内，5 ng（A）和50 ng（B）K562样本三次重复检测鉴定和定量蛋白质数目。从24周到28周（绿色阴影框），>1020µg K562模拟高通量实验。鉴定和定量的蛋白质的数量分别以浅蓝色和深蓝色柱状表示。淡红色和深红色线条分别表示鉴定和定量的前体离子数量。第24-25周(含)，每进样36µg总蛋白量样本，检测QC样本（K562）。在第26-28周(含)，每进样72 µg总蛋白量间隙，检测QC样本（K562样本）。在21周的测试期间，鉴定和定量的蛋白质和前体离子的CV值低于20 %(总结见表1)。

方法

样品制备：

人K562胰蛋白酶解产物购自Promega。2个QC样品：浓度分别为(a) 50 ng/µL和(b) 5 ng/µL。

色谱和质谱源条件:

Waters M-Class液相色谱系统，Phenomenex Kinetex XB-C18 (0.3 mm x 150 mm, 2.6 µm)分析柱，流速为5 µL/min，直接进样。ZenoTOF 7600系统采用OptiFlow Turbo V离子源，配备1-10 µL/min微升流速探头。源参数设置：离子喷雾电压5000 V，源温度200 ℃，气帘气35 psi，gas1 20 psi，gas2 60 psi。

Zeno SWATH DIA方法:

20 min液相色谱梯度(总时长30 min)，QC样本：5 ng和50 ng K562。Zeno SWATH DIA方法：65个可变窗口(Q1质量范围400-750 m/z)，SWATH TOF MS累积时间50 ms, TOF MS/MS累积时间13 ms。加速稳健性测试分析(每次分析0.5 µg和1 µg K562样本)：方法分别以5 min(总时长12 min)和10 min (总时长20 min) 梯度运行。较短的梯度方法使用了类似65个可变窗口SWATH方法，MS/MS采集不使用Zeno trap。5 min和10 min梯度，TOF MS/MS累积时间分别缩短为9 ms和11 ms。

实验时间线:

ZenoTOF 7600系统连续使用28周，期间没有任何后续的仪器清洁/维护。从第8周开始，定期进行QC样本检测，以评估LC-MS系统稳定性。QC样本为5 ng和50 ng K562样本，进行20 min梯度Zeno SWATH DIA分析。在第24-28周期间，连续5周检测 > 1020 µg K562样本进行加速稳健性试验。5 min和10 min梯度重复检测0.5 µg或1 µg的K562样本，使用SWATH DIA方法，在不激活Zeno trap的情况下进行二级质谱采集。在此期间，每检测36 µg (24-25周)或72 µg (26-28周) K562样本，进行QC样本（5 ng和50 ng K562样本）重复检测。另外，每检测36 µg总蛋白时单独进行一次50 ng K562样本检测。在为期28周的实验中，仪器进行了3次通气，其中2次将仪器移动到新的位置(图1、2、4中的第9、26、2、28、3周)。

数据处理:

QC样本（5 ng和5 0ng K562）Zeno SWATH DIA数据使用DIA- NN软件(V1.8.1)进行分析，数据库为通过高pH液相色谱分离和数据依赖型采集获得的数据构建人K562和HeLa样本谱图库2。默认设置：打开match between runs (MBR)，cross-run normalization设置为RT-dependent。蛋白质和前体离子鉴定设置为1 % FDR，DIA-NN软件输出数据结果(分别为pg_matrix.tsv和pr_matrix.tsv)并同时统计定量CV < 20%数据。

超过21周测试中，选择38次采集的50 ng K562样本数据，使用DIA-NN软件检索整合的K562/HeLa谱图库。数据库检索时关闭MBR和cross-run normalization，使用输出文件pg_matrix.tsv和pr_matrix.tsv中蛋白质和前体离子强度值绘制散点图。选择来自K562鉴定肽段和肽段峰面积（来自DIA-NN软件输出文件）并绘制散点图。

QC样本三次重复检测鉴定

和定量蛋白质和前体离子

从第8周开始，为期21周的时间内，在ZenoTOF 7600系统上应用Zeno SWATH DIA定期对QC样本（K562）进行分析。在第8周至第24周期间，在QC样本检测之间，应用Microflow LC-MS模式对各种不同的蛋白质组学样本进行分析。在24周，应用SWATH DIA方法连续检测0.5 μg或1 μg K562样本进行加速稳健性检验，模拟多周、高通量实验。在第一个23周，大约检测了130 µg 蛋白酶解产物，在24-28周检测样本 > 1020 μg蛋白，进行加速稳健性测试。(图1)。该数据表明，试验期间，尽管检测蛋白样本量> 1200 μg，期间没有进行任何的仪器清洗。50 ng K562样本进行三次采集(图1A)，使用Zeno SWATH DIA方法，20 min梯度时间分析。超过21周QC测试，总鉴定蛋白质在4859-5717之间 (平均5411) （1% FDR）。其中，3554-4595个蛋白质定量CV < 20%。该系统显示在整个测试期间，鉴定和定量蛋白质的最小变异系数分别是4.2 %和6.3 %。同样的，鉴定到的前体离子数量在30725-39661 (平均36445)之间，其中18567-26673个前体离子 (平均23019) 定量CV < 20%。在整个测试期间，鉴定和定量的前体离子的CV分别为6.2 %和8.7 %。

使用5 ng K562样本进行了类似的评估（图1B）。在整个测试期间，蛋白质鉴定数量在2068-3014（平均2578）之间，1029-1592个（平均1348）蛋白质定量CV < 20%。前体离子鉴定数量在9469-16000（平均12887）之间，3477-6356个（平均5093）前体离子定量CV < 20%。如预期，相较于50 ng进样量，5 ng K562样本数据（鉴定到的蛋白质和前体离子 CV分别为10.3 %和13.8 %）具有更多的变化。数据如表1所示。

表1. 21周测试期间，K562样本三次重复检测鉴定和定量蛋白质和前体离子重现性。

单针QC 50 ng K562样本检测

和定量蛋白质和前体离子

在8-23周之间，进行单针QC（50 ng K562）分析，以及在24-28周（一共38个数据文件）每分析36 µg K562进行QC检测，数据使用DIA-NN软件进行分析，参数设置：MBR或交叉运行归一化功能关闭，在无偏差处理条件下评估仪器性能。结果如图2所示。在该数据集中，鉴定蛋白质4732-5426个（平均5218个），鉴定前体离子27329-35224个（平均32717个）。蛋白质和前体离子的CV分别为3.7 %和6.3 %。在8-28周之间，前体离子总共鉴定到46465个，其CV平均值和中位值分别是38 %和28.7 %（图3）。

图2. 连续21周测试，50ng K562 QC样本鉴定总蛋白质和前体离子。蓝色柱状和红色线条分别表示鉴定蛋白质和前体离子数量。在24-28周（绿色框），进样 >1020 µg蛋白质进行加速稳健性测试。

图3. 小提琴图显示了50 ng K562样本三次重复分析总共46465个前体离子CV分布。前体离子CV平均值和中位值分别是38 %和28.7 %。

图4. 超过21周 QC测试，K562样本中5条肽段未归一化峰面积。图中展示测试期间每条肽段CV%值。