裂谷热诊断技术PCR方法

RT-PCR已经用于蚊子和临床样品中RVFV的检测。Sall等用RT-PCR对NS（S）蛋白编码区进行序列分析，用于系统发育分析以鉴定病毒的两个不同谱系，发现一个是埃及的，另一个是撒哈拉的，使得RT-PCR成为分子流行病学的有力工具。

Ibrahim等从M节段的高度保守的区域设计了两对PCR引物用于RT-PCR和巢式RT—PCR，所扩增的序列为G2糖蛋白基因的一部分。由于在GenBank中只能查到ZH—501和ZH—548M12毒株M节段的全序列，但是可以得到其他24株毒株的部分核苷酸序列；当这些从26个不同的毒株中已知的核苷酸被比对时，从90—1711bp重叠部分有95．5％一100％的同源性，表明这一区域在RVFV里面是高度保守的。Battles等也已表明这一区域在来自不同宿主的6个非洲国家超过34年的收集到的22分离株间是高度保守的。尽管在这项研究中使用的引物只在一株裂谷热病毒中被测试，Ibrahim等预言这些引物如果不是全部但也可
能扩增大部分RFV病毒株，因为这些引物是在高度保守的区域内选取的。另一方面，这些引物同非裂谷热的其他白蛉热病毒序列的同源性较低，暗示了同其他白蛉热病毒应该没有交叉反应性。

Sall等在RVFV的S节段设计了保守的寡核苷酸引物，建立了一管巢式RT-PCR方法，当RVRV人为地用人正常血清进行系列稀释时，使用简单的RT-PCR和巢式RT-PCR分别可以检测到zui小50个PFU和0．5个PFU。RT-PCR方法对于检测试验感染的小鼠和骆驼的血中的裂谷热病毒RNA是有效的，并且发现巢式RT-PCR比病毒分离方法更为灵敏。这一方法被成功地运用于1998年毛里塔尼亚暴发时人的病例的检测。同时作者指出，血清学方法（1sM和IgG捕获ELISA）在用于病毒感染晚期收集的样品的检测时是适当的；而应用早期样品进行诊断时，RT-PCR或者病毒分离是应当首选的。当此方法同IgG抗体检测相结合时，与病毒分离（Ⅵ）方法的符合率可以达到100％，可以与IgG检测结合被作为RFV早期疑似病例的常规检测方法。

Espach等也建立了一管法RT-PCR方法检测早期血清或者血液样品中的RVFV，扩增序列位于病毒的M节段的糖蛋白基因，检测灵敏度比Sail等所建立的巢式RT-PCR方法高，可以达到0．25 TCID5。，相当于0．17PFU。

非常值得注意的是试验的灵敏度依赖于几个因素，如样品来源、核酸提取方法、RT—PCR扩增和热循环条件等，在不同的实验室使用的条件可能都需要优化。例如从蚊子中提取裂谷热病毒RNA的方法，尽管可能在25只或50只感染的蚊子当中检测一个感染的蚊子（只有当RNA样品用酚：三氯甲烷重新提取，并且用异丙醇重沉淀时），使用10只或者更少的蚊子群体避免了RT-PCR抑制剂，但是如果使用更多的蚊子样品，可能需要增加酚；三氯甲烷或改变RNA提取程序。

Real-timePCR方法 Garcia等首先运用Real—time PCR中的TaqMan技术建立了检测RVFV的方法，目的片段位于NSs区域。使用从含有目的基因的质粒体外转录合成的RNA建立了标准曲线，Real-timeRT-PCR用从感染的Vero细胞得来的RVFV进行了评估，发现这一方法对RVFV是特异的，并且被成功地运用于感染了RVFV的动物血清样品中病毒基因组的检测，灵敏度为可以检测到50—100个拷贝（用人工合成的RNA进行评估）和10 TCIDs。每毫升的病毒量；并且运用此方法评估了抗病毒药物的抗病毒效果。另外，Drosten等也建立了能够鉴别病毒性出血热相似症状的几种不同病毒的Real-timePCR方法，其中包括使用Taq—Man技术检测RVFV，所设计的目的扩增片段位于G2基因。Real-timePCR作为一项RVF早期确诊和随后的抗病毒治疗评价的常规检测方法将十分有用。