要做PCR的血液标本如何保存

最好是用淋巴细胞分离液把单个核细胞分离出来，然后-80℃保存。

外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。

【原理】  

血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得PBMC。

    【器材与试剂】

    1.刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等。

    2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液，淋巴细胞分层液。

    【方法】

1.静脉取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血样本)的试管中，混匀，使血液抗

凝。用pH7.2 Hanks液将抗凝血稀释1倍。

2.吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45O角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。

3.在18℃～20℃下，用水平离心机以2000r/min离心20min。离心后细胞分布如图。

 4.用毛细吸管轻轻插到混浊带，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管中。即要吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成分。

5.用Hanks液洗涤细胞3次。第一次2000r/min ，10 min；第2～3 次1500r/min ，10 min，可去掉大部分混杂的血小板。

6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。

        【注意事项】

    1、实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时，上述操作过程都要在无菌条件下进行，所用器材、试剂都应为无菌。

    2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关。分层液应避光4℃保存。

3、往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时，不得将血液冲入分离液中，须保持两层液体的清晰界面。