诱变PCR实验

氯仿 异戊醇乙醇矿物油或者一个蜡珠3mol L NaOAc5 mmol L MnCl2突变 PCR 缓冲液DNA 聚合酶Native Taq 或 AmpliTaq DNA 聚合酶高纯度的脱氧核苷 5'-三磷酸dNTP 混合物模板 DNA引物琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色

热循环仪

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

氯仿/异戊醇（24:1，体积比）

乙醇，100%

矿物油或者一个蜡珠

3mol/L NaOAc,pH5.2

5 mmol/L MnCl₂

1X 突变 PCR 缓冲液

70 mmol/L MgCl₂

500 mmol/L KCl

100 mmol/L Tris-HCl,25°C 时 pH8.3

1g/L 明胶

2. 酶和酶缓冲液

DNA 聚合酶

Native Taq 或 AmpliTaq DNA 聚合酶（Applied Biosystems 或者其他有执照的供应商不要用其他热稳定 DNA 聚合酶替代

3. 核酸和寡核苷酸

高纯度的脱氧核苷 5'-三磷酸（Pharmacia，USB/Amersham)

10XdNTP 混合物，包含 2 mmol/LdGTP、2 mmol/LdATP、10 mmol/LdCTP 和10mmol/LdTTP

模板 DNA

引物

4. 凝胶

琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色

5. 特殊设备

热循环仪

二、方法

1. 准备 10X 突变 PCR 缓冲液。

2. 准备10XdNTP 混合物。

3. 准备一个 5 mmol/LMnCl₂ 溶液，不要与 10XPCR 缓冲液混合，否则将产生沉淀干扰 PCR 的扩增。

4. 将 10ul 10X 突变 PCR 缓冲液、10ul lOXdNTP 混合物、每种引物各 30pmol 以及20fmol 模板 DNA 混合在一起，用 H₂0 将总体积补齐至 88ul，然后混匀。

5. 添加 10ul 5 mmol/L MnCl₂ 溶液，充分泥匀确保没有沉淀形成。

6. 添加 5U(2ul)Taq DNA 聚合酶，将最终体积定为 100ul, 轻轻混匀。如果需要的话，可以覆盖矿物油或一个蜡珠。

7. 以 94°C 1 min、45°C1 min、72°C lmin 温育 30 个循环。不要设定热启动步骤，也不要在最后一个循环的末尾设定延长的延伸时间。

8. 纯化反应产物，首先用氯仿/异戊醇（24:1, 体积比）抽提，随后用 0.25mol/LNaOAc 和 2.5 倍 100% 乙醇沉淀。

9. 将一小部分纯化的产物在琼脂糖凝胶中检测，经溴化乙锭染色后确认全长的产物的量是否令人满意。突变 PCR 应该与标准 PCR 平行进行（忽略上面所列的 4 点不同这两种 PCR 所得到的全长 DNA 的量应该相差不多。