质粒提取的方法和影响因素

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，质粒提取是分子生物学最常见的实验之一。目前质粒提取实验大多借助试剂盒来完成，那么关于质粒提取的原理，您的了解足够深入吗？

目前，质粒提取试剂盒最常用的方法是碱裂解法。碱裂解法原理：根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，再采用吸附柱对质粒进行吸附、去杂质、洗脱，就完成了质粒提取的实验。

在进行质粒提取实验室，有时候质粒提取的浓度不高，达不到后续进行转化或转染的实验要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面跟随星博士一起来看一下质粒提取有哪些影响因素吧！了解它的影响因素，就能够做出相应的实验方案调整，从而得到更高浓度的质粒样本啦！

影响质粒提取的因素：

质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素等。

宿主菌的种类和培养条件

多数情况下宿主菌为大肠杆菌，而菌株的不同会影响质粒提取的质量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）会在裂解时产生大量的糖类，如果没有完全去除，将抑制后续实验中的酶活性，影响质粒DNA提取的质量。

由于无质粒的子细胞在无抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。因此，宿主菌株接种到液体培养基中培养的过程中，务必加入抗生素进行筛选。宿主菌接种到含相应抗生素的液体培养基中，振荡培养12-16小时，不应超过16小时。超过16小时后，细胞开始裂解，使得质粒的得率降低，也可能导致质粒丢失或质粒变异。

不同质粒间的差异

质粒提取最终的浓度，最重要的影响因素之一就是质粒拷贝数。质粒拷贝数是指生长在标准的培养基下每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目，每个细菌中的质粒的拷贝数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制机制，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细菌染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细菌内只含1-2个质粒；另一类是松弛型质粒，当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细菌内一般含20个左右质粒拷贝，这些质粒的复制是在寄主的松弛控制之下的。高拷贝质粒与低拷贝质粒在相同条件下进行质粒提取，高拷贝质粒浓度会高于低拷贝质粒的浓度。不同拷贝数的质粒，菌液量的需求不同，对于低拷贝的质粒，要相应增加菌液的量。

在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质粒的拷贝数。因为氯霉素能抑制宿主细胞蛋白质和DNA的合成，但对松弛型质粒的复制没有影响。由于氯霉素抑制了宿主细胞蛋白质和DNA的合成，从而抑制了染色体的复制，但质粒复制所用的酶半衰期较长，故质粒仍可继续复制，这样既可增加质粒产量，又可降低细胞的数量，使细菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用浓度为20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高质粒提取的浓度。

质粒鉴定与评价：

琼脂糖电泳检测：

碱裂解法提取的质粒经琼脂糖电泳进行鉴定时，理想状况是只出现超螺旋—条带，但在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等原因，使质粒DNA链发生断裂，可能出现两条带或者出现三条带，这三条带电泳迁移率从快到慢，分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒粘连在—起)。

如果加溶液Ⅱ后过度振荡，会在远离这三条带的位置出现条带，这条带泳动得较慢，是大肠杆菌基因组DNA的片断，因此要注意加完P2、P3后轻柔混匀。质粒提取是否有基因组污染，可以进行单酶切验证，酶切后有单一条带，就证明质粒提取的产物是单一的。
 
浓度及纯度测定：

用紫外线分光光度计检测浓度测定标准为：OD 260 值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。OD 260 /OD 280 比值在1.7-1.9之间说明所得DNA纯度较好。OD 260 /OD 280 比值若低于1.7说明可能有蛋白污染。OD 260 /OD 280 比值若高于2.0则说明DNA有可能已降解。

【AD0102】

泳道 1：Spark 10000 DNA Marker

泳道 2-4：提取后的 pUC19 质粒 (2.6kb)

泳道 5-7: 提取后的 Hyg 102(10.2kb)

泳道 8-10：提取后的 pShuttle-CMV 质粒 (7.5kb)

泳道 11-13：提取后的 plentiCRISPR V2 质粒 (14.8kb)

质粒提取试剂盒实际验证效果（AD0102）如上图所示。无需柱平衡，30min内可完成多个样本的质粒抽提。针对不同提取量，思科捷推出小提、中提、大提的试剂盒，可满足大肠杆菌、酵母等不同菌株的质粒提取需求。若后续进行转化实验，无内毒素的质粒提取试剂盒所得的质粒，能够满足您进行细胞培养的要求。