质粒提取（二）

2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ

0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)

1%SDS

盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面

均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ

溶液Ⅲ

5mol/L乙酸钾 60ml

冰乙酸 11.5ml

水 28.5ml

所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。

盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后

将管置于冰上3-5分钟。

4)用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

5)可做可不做:加等量酚:氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。

6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。

7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。

8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。

i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg。

ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。

iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:

3.煮沸裂解

1)将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。

STET

0.1mol/L NaCL

10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

1mmol/L EDTA(pH8.0)

5% Triton X^-100

2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。

3)将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。

4)用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。

5)用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。

7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。

8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。

9)加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。