质粒DNA大量制备实验

大肠杆菌

葡萄糖 Tris EDTA TE NaOH SDS 异丙醇 乙醇 乙酸甲

离心机 漩涡混合器 水浴锅

1.  往2 ml 烧瓶中加入500 ml ，含有适当抗生素的LB培养基，然后加入5 ml 过夜培养的。

2.  带有所需质粒的大肠杆菌培养物，再于37℃培养至饱和状态（OD₆₀₀≈4）。
 

3.  于4℃，6 000 g 离心10 min，用4 ml GTE。

4.  溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20 ml  的高速离心管中。（细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存。）

5.  加入1 ml 新配的含25 mg/ml 溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10 min。

6.  加入10 ml 新配的NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠。于冰上放置10 min。

7.  加入7.5 ml 乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置 10 min。

8.  于4℃，20 000 g 离心10 min 将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤。

9.  加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室溫放置5~10 min。

10.  于室温1500 g 离心10 min。

11.  加入2 ml 70%乙酵轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。

12.  沉淀可以在4℃无限期保存。