质粒DNA导入细菌细胞实验

菌落 质粒DNA

CaCl2

培养基 平板

1.  接种一个单菌落于50 ml LB培养液中，于37°C中速摇床培养过夜（250 r/min)。

2.  往一个2 L的烧瓶中加人400 ml LB培养液，再加入4 ml过夜培养液，于37°C摇床（250 r/min）培养至 OD₅₉₀为 0. 375。
 

这一步的目的是使细菌快速生长（对数早期或中期）。

3.  将培养液分装到8个50 ml预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5〜10 min。

4.  于4°C，1600 g离心7 min。细胞沉淀用10 ml冰冷的CaCl₂溶液重悬。

5.  于4°C，1100 g离心5 min。细胞沉淀用10 ml冰冷的CaCl₂溶液重悬，冰上放置30min。

6.  于4°C，1100 g离心5 min。用2 ml冰冷的CaCl₂溶液重悬各管细胞。

7.  为了长期保存，按每管250 μl的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中，立即冻存于-70 °C。

8.  为检测感受态的效果，按照以下各步骤将10 ng pBR322转化到100 μl感受态细菌。
 

将合适体积的转化物（1、10和25 μl）涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，37 °C培养过夜。
 

转化的大肠杆菌MC1061和DH1细胞一般可以产生10⁵~10⁸克隆数/μg DNA。

9.  将10 ng DNA (10~25 μl)加人到一个15 ml无菌的圆底试管中，并放置冰上。

10.  将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速融化，立即将100 μl感受态细菌加入到管中，轻轻旋动，并放置冰上10 min。

11.  将管放人42°C水浴2 min进行热激，然后加人1 ml LB培养液于每一支试管中，于37 °C置滚筒式摇床（250 r/min)培养1 h。

12.  将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上，于37 °C培养12~16 h。
 

对氨苄青霉素来说，最适宜的密度是每个平板上的细胞≤500，这样是为了防止弱抗性的卫星菌落的生长。

13.  短期保存，可以将平板和剩下的含质粒的细菌培养物储存于4°C。长期保存则准备甘油或DMSO存储液，保存于-70°C。取出保存的细胞于选择性平板生长，用酶切检测质粒DNA 。

1.  所有与细菌接触的物品和液体都应该是无菌的。