质谱常用离子源

　　无信号/荧光强度弱

　　不正确的信号补偿:检查流式细胞仪阳性单一颜色对照是否正确，通道和补偿设置是否能正确地捕获所有粒子；没有足够的抗体来检测:增加抗体的量/浓度；无法接近细胞内目标:检查目标蛋白是否在细胞内。

　　对于胞内染色，确保有足够的通透性。为防止细胞表面蛋白质的内化，该过程应用冰冷的试剂，在冰上或 4 °C进行，以终止一切反应。加入叠氮钠可防止表面抗原的修饰和内化带来的荧光强度的损失。对于细胞系染色，胰蛋白酶可以引起细胞表面蛋白质的内化，尤其是细胞表面分子，可能需要更温和的分离方法；

　　细胞内染色结合荧光分子太大:对细胞内染色实验，荧光分子应具有较小的分子量。大分子量荧光染料会降低抗体的动力和其进入细胞的可能性；

　　激光器未对齐:确保流式细胞仪的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微球来调整路线。如果激光器不能正确对准或发生漂移时，您可能需要考虑联系此机的客服；

　　目标蛋白不存在或处于低水平表达:确保组织或细胞类型表达的目标蛋白处于一个足够检测的量；

　　可溶性或分泌型目标蛋白:目标蛋白是否可溶并从细胞内分泌？需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里以便流式细胞仪能很容易检测到。通过高尔基体封闭的步骤，比如加入 Brefaldin A，可提高细胞内染色信号；

　　补偿过高或增益过低:使用阳性对照再次设置流式细胞仪，利用补偿以确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理的范围内）；

　　荧光分子的荧光逐渐消退:抗体可能放置时间太长或没有避光，新鲜抗体是必需的；

　　一抗和二抗不匹配:二抗应该是和一抗来源物种相同（例如第一抗体来源于兔，就要使用抗兔的第二抗体）；

　　荧光强度过高

　　抗体浓度过高:这将导致较高的非特异性结合或非常高的荧光强度。减少每个样本中加入的抗体量；

　　过量抗体被困:这是细胞内染色特有的问题，较大的荧光分子使抗体被困在细胞中。确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton；

　　封闭不足,与封闭步骤一样，抗体中加入1-3% 封闭试剂；

　　背景高或阳性细胞百分比高

　　增益设置过高或补偿过低:使用阳性对照再次设置流式细胞仪，用补偿减少小颗粒背景并减少增益以降低信号；

　　抗体过量:降低抗体浓度。您还可以在洗涤缓冲液中添加去污剂，以确保洗去多余的抗体；

　　观察到两个或多个细胞群但应该只有一群细胞

　　不止一类细胞表达目的蛋白:检查样品中所有细胞类型的预期表达水平，如果必要确保细胞充分分离；

　　出现细胞双峰:细胞双峰在图上显示两倍的荧光强度的第二种细胞类型。染色前轻轻地混合细胞，在放入流式细胞仪前用吸管再次混匀，也可以筛选或过滤细胞以除去团块（30 μm 的尼龙网）；

　　侧向散射背景偏高（来自小颗粒）；

　　细胞裂解:确保样品中细胞没有裂解和破裂。样品应是新鲜的并且是正确制备的。细胞不能高转速离心或剧烈震荡；

　　细菌污染:确保样品不受污染。细菌会低水平自发荧光，这也会导致高粒子率。

　　低粒子率

　　每毫升的细胞数量太少:制备 1 × 10 6 个细胞/ml。确保细胞充分混合（操作要轻）；

　　细胞聚集，阻塞管道:染色前轻轻吹打几次确保形成同源单细胞悬液。确保运行之前再次混匀。在极端的情况下，可筛选或过滤细胞以去除团块（30 μm 的尼龙网）；

　　高粒子率

　　细胞数量过多:将细胞稀释成 1 × 10 5至 1 × 10 6 个细胞/ml 样品。

　　引用某实验学生问题：

　　最近在培养肝星状细胞，每次传代时用胰酶消化，不到一两分钟，细胞就成片状漂起。让老师帮我传代也是，细胞一起子就漂起来了，她说假如难以把握消化程度的话，让我把细胞全部消化下来再离心。全部消化下来是什么意思？但是细胞成片状漂起是不是细胞已经消化过度了呢？对细胞影响还是很大的吧，比如说影响贴壁和活力。

　　答：消化过度对细胞是有一定影响的。

　　可以采取加入小量血清抵抗胰酶的作用。

　　对待这种情况时具体操作如下；

　　加入少许血清，之后加入适量的 培养液，充分吹打成单细胞，之后转移到灭菌的离心管中，封口膜封住，1000转左右，离心5分钟，小心的倾去上清，加入适量培养液，重新吹打成单细胞，之后正常操作 。