质谱鉴定常见问题解答

　　 1. 一级质谱和二级质谱有什么区别？什么时候做一级，什么时候做二级？

　　答：一级质谱鉴定的方式主要指胎指纹图谱（PMF），即利用质谱仪精确测量酶解片段的分子量并搜库比较实现蛋白质的鉴定，二级质谱是在一级质谱的基础上再选择部分肽段做进一步的破碎并对碎片进行深入分析和比较，鉴定出该肽段的序列并结合PMF的结果从而实现蛋白质的鉴定。二级质谱能够得到部分肽短的序列，具有更高的可靠性。随着现在杂志对数据的要求越来越严格，二级质谱鉴定是蛋白鉴定的大趋势，而且即使目前做一级质谱鉴定的结果，也需要挑选部分PMF结果做二级质谱验证。

　　2. 研究的物种不是模式生物怎么办？

　　答：可以参考亲缘关系最近的模式生物做比对而实现蛋白质的成功鉴定，如果质谱图很好而没有鉴定结果说明这是一个全新的蛋白，可以采用de-novo等技术做深入分析与鉴定。

　　3. 该如何评价质谱效果的好坏？

　　答：做PMF一般得分超过60分（P<0.05）就算成功鉴定，而串联质谱，得分超过60分或者虽然没有超过60分，但是有最少一条肽段的得分超过30分就算成功鉴定。

　　4. 一些特殊的质谱方法有什么用途？

　　答：质谱的其它用途包括磷酸化位点分析、蛋白测序、混合蛋白鉴定（shotgun技术）以及分子量精确测定、二硫键位置分析等等。

　　5. 用什么染色方法比较好？

　　答：最好用考马斯亮蓝法进行染色，银染也可以，但鉴定成功率稍低，并且推荐用串联质谱对银染蛋白进行鉴定可以大大提高鉴定成功率。

　　6. 凝胶是否可以长期保存？该如何保持？对鉴定效果有影响吗？

　　答：如果保存时间超过一个月，可以用保鲜膜包裹后放入冰箱保持，如果小于一个月，则可以常温保持，不会影响质谱鉴定效果。

　　7. 质谱鉴定取胶点该如何取？有什么注意事项？

　　答：取点的时候将0.2ml的枪头前端剪去一点，用枪头将凝胶戳取下来并转移至0.5ml离心管中，用水将胶粒反复吸打冲洗两至三次，最后吸干离心管中所有水分封盖保存。离心管最好用进口离心管，以免塑料污染；水最好用去离子水或者双蒸水；取点的时候带好口罩与手套，以免角蛋白污染。