赭曲霉毒素A的HPLC检测（二）

饲料样品前处理

将样品粉碎，称取5g试样（精确至0.01g），分别准确加入OTA标准溶液适量，混合均匀。准确加入20ml乙腈-水（60:40）溶液，涡旋1min，超声提取20min，在5000rpm的条件下离心10min。取上清液8ml，氨水调pH至8.0，待用。另做试样空白对照。SPE操作过程见图1。

仪器方法

高效液相色谱条件：Agilent 1260液相色谱仪，配FLD检测器；色谱柱，Agilent Poroshell 120 SB-C18 （4.6×75mm，2.7μm，PN. 687975-902）；流动相，A=1%乙酸-乙腈，B=1%乙酸-水，梯度洗脱，见表1；流速，1.0ml/min；进样量，20μl；柱温：30℃；运行时间，12min，后运行时间为4min；FLD，Ex=333nm，Em=477nm。

图4. OTA标准曲线。

结果与讨论

样品前处理方法的考察

OTA属于弱酸性化合物，其结构中的苯基丙氨酸部分的pKa=4.4，所以在上样前将提取液的pH调至8，OTA在pH大于7以上时基本以羧酸根阴离子状态存在，在上样时可以很好地被Bond Elut Plexa PAX以阴离子交换作用保存。然后采用4%氨水和甲醇分别洗去一些极性和非极性干扰物。试验结果表明PAX可以对OTA进行很好的保留和洗脱，且与反相机理相比，具有更好的选择性。

图5. OTA标准品、空白样品和添加回收率叠加色谱图。

仪器方法

本文用安捷伦1260 Infinity HPLC-FLD检测器，结合安捷伦ZL的薄壳型快速分析色谱柱Poroshell 120 SB-C18 分析OTA，主峰出峰时间为8.84min左右，方法整体运行时间为16min，在方法流动相条件下最大系统压力仅为126bar，在连续分析几天样品后，色谱柱压力没有产生任何变化。这表明Poroshell 120系列色谱柱具有一定的耐脏性能，同时可以在常规液相色谱仪上实现高效快速分析。方法考察了样品溶剂效应，发现将进样体积增加到20μl时，如果用甲醇作为标准品溶剂，会具有很明显的溶剂效应。因此直接采用流动相作为工作曲线溶剂和样品溶剂。方法还考察了仪器的稳定性，六针重复进样的RSD为0.74%，具有很好的重复性，见表2。经过优化后的色谱图见图2。

仪器方法考察了灵敏度，线性范围及添加回收率等指标。其中灵敏度测试了1ppb浓度OTA标准品，其信噪比为10.7，结果如图3所示。在1~100ppb浓度范围内，测试线性相关系数大于0.9999。如图4所示。

方法的重复性

分别向空白饲料中，加入0.01、0.05、0.1μg/kg三个添加量的OTA标样，按照本方法的处理过程制备样品并进行测定，OTA在饲料中的绝对回收率在85%~99%之间，RSD在1.16%~2.15%之间，见表3；标准品、空白样品和标准添加样品的谱图如图5所示，可以看出OTA经Agilent Bond Elut Plexa PAX净化后，基本无基质干扰，可以达到很好的净化效果并且得到很高的回收率，提高了定量结果的准确性。

小结

利用安捷伦 Bond Elut Plexa PAX强阴离子交换固相萃取结合安捷伦1260 Infinity HPLC-FLD高灵敏度高选择性检测器，可以实现对饲料中OTA残留的定量分析。采用安捷伦Plexa PAX阴离子交换固相萃取，可以实现快速高效高选择性的净化处理，净化后的样品基质效应和基质干扰均很小，绝对添加回收率可达到86%以上；采用FLD分析结果表明在1ppb浓度下OTA的信噪比（S/N）=10.7；在1~100ppb浓度范围内,线性关系和稳定性都很优异，相关系数R>0.9999。