跟着论文做实验：凋亡的多参数检测

　　大家都知道，在细胞凋亡的早期，线粒体膜电位的下降是一个标志性的事件。而对于线粒体膜电位的检测，JC-1这种亲脂性阳离子染料是个很好的工具，也使用了很多年。

　　当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；而当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。这样就可以很方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。人们常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体膜去极化的程度。

　　对于传统的JC-1检测，在使用带有单个488 nm（蓝色）激光器的流式细胞仪进行分析时，JC-1单体和JC-1聚合物这两个检测通道需要荧光补偿。在今年4月发表于《Current Protocols in Cytometry》的一篇文章中，意大利摩德纳大学的Sara De Biasi等人对此方法进行了改进。他们使用的是赛默飞世尔的Attune™ NxT声波聚焦流式细胞仪。

　　这种仪器采用模块化设计，配有红、黄、蓝、紫四个激光器。作者认为，多激光器的使用能最大限度减少荧光补偿的需要，从而有助于实现更轻松、更高效的检测。同时，多激光器的激发也让作者能够检测其他的凋亡标志物，如PS外翻和活性氧簇的形成。

　　在这项研究中，De Biasi及其同事使用两个激光器来检测JC-1：蓝色（488 nm）激光器来激发JC-1的单体，而黄色（561 nm）激光器来激发JC-1聚合物。他们利用缬氨霉素（valinomycin）处理U937细胞后，开展JC-1染色。在使用单色激光激发时，不使用补偿就无法轻松分开JC-1的单体和聚合物；不过，在使用双色激光激发时，就不需要荧光补偿。

　　在同时检测多个凋亡标志物时，作者利用两种额外的探针：Pacific Blue™ annexin V检测磷脂酰丝氨酸的暴露（紫色激光），而CellROX™ Deep Red试剂检测活性氧簇（红色激光）。同时使用Attune™ NxT流式细胞仪上的四个激光器，作者证明了三种凋亡标志物的检测。他们认为，这些方案适用于凋亡的多参数检测。