转基因复印数荧光定量PCR办法

转基因复印数荧光定量PCR办法

         挑选一种合宜的阳性标准品来画出标准曲线，是应用实时荧光定量 PCR 技术正确认量模型板起初液体浓度的基础。近年来，国里外的科学家做了不一样的试验。Song(2002)等觉得理想的标准品应当是已插进去外源基因的植物基因组DNA ，况且用Southern blot正确测得插进去的外源基因复印数。不过在实际研讨中，很不容易得到到这么一套标准品。因为这个，他提出代替方案，依据外源基因复印数和野生型植物 DNA 的体积，按一定液体浓度比值混合，制成标准曲线。例如，在玉茭的外源基因复印数研讨中它们发觉，在参加荧光染布材料SYBR GREEN I的20 μL PCR反响整体体系中，应以6 ng野生型玉茭基因组DNA 作为模型板量。已知玉茭基因组DNA 体积为2.5 × 10.9 bp(Armuganathan和Earle 1999)，相应于6 ng的玉茭DNA ，即可计算出摹拟1、2、4、8、16个外源基因复印时，应参加的质粒 DNA 的量。

        利用新式、锐敏、高通量的实时荧光定量PCR办法可以用于标定原始品系中转基因的完全复印数。实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量办法。其定量的基本原理是在PCR反响整体体系中参加非特别优异性的荧光染布材料(如：SYBR GREEN I)或特别优异性的荧光探针(如：Taqman 探针)，实时检验测定荧光量的变动，取得不一样样品达到一定的荧光信号(阈值)时所需的循环回数：CT值(Cycle Threshold)；经过将已知液体浓度标准品的CT值与其液体浓度的对数画出标准曲线，就可以正确认量样品的液体浓度。荧光定量 PCR 技术具备简单方便、敏捷的长处，能够管用扩增低复印的靶断片DNA ，对每克样品中20 pg-10 ng的转基因成分施行管用检验测定。同时，与Southern法相形，荧光定量PCR技术可对T-DNA 的不一样序列施行扩增，因为这个能成功实现对品系中的基因重组的检验测定干燥箱KLYQ、生化培养箱。

以这些个梯度混合液作为标准品，就可画出标准曲线，检验测定样品的液体浓度并计算插进去的复印数了。实验表明，用这种办法取得的数值和 Southern blot 的zui后结果相当完全一样。Giovanna(2002)将农杆菌介导的转基因西红柿作为研讨材料，挑选了双元载体T-DNA 区上的两个外源基因TSWV-N(Tomato spotted wilt virus)、nptⅡ(neomycin phosphoril-transferaseⅡ)和一个单复印的内源基因(endogenous gene)作为荧光定量PCR扩增的模型板，检验测定外源基因复印数。他觉得运用植物基因组 DNA 和一定比例质粒的混合液作为标准品，会累积很多没有办法防止的误差。譬如运用这种标准品不可少预先晓得待测植物基因组 DNA 的非常准确分子量，并对植物 DNA 和质粒正确认量，但在大部分数事情状况下获得的数值都只是近似商，再以资混合液作为标准品检验测定每一植株的外源基因复印数时，便会放大这些个误差。

因为这个，他提出“相对CT”或“δ-δCT”的办法，这个办法的长处是不必为每每实验制造标准曲线，只消一个优化步骤证实外源基因与内源基因有相同的，至少是相仿的反响速率即可。与其他定量技术如 Southern Blot 相形，实时定量 PCR 技术的特别优异性和高信嗓比特别的性质为转基因复印数定量供给了一点便捷。与实时定量 PCR 相形，DNA 点杂交技术要消耗的钱价不低的试药、劳力以趁早间。每个条带至少需求2微克的 DNA 用于放射性检验测定或是至少 10 微克用于荧光检验测定，因为这个，需求数量多的团体样品，实验务必等到每个植株通过传代能够供给足够数目的团体后才可以用于检验测定复印数。电热恒温鼓风干燥箱、干燥箱KLYQ、培养箱KLYQ。

假如存在重组的话，zui后结果将更为复杂。定量PCR剖析的转基因复印数稍高于Southern Blot的剖析zui后结果，主要端由是Southern Blot办法在同一个插进去位点有多复印的T-DNA 断片插合乎时尚，转基因植株的在绝对酶切特殊情况萌生相仿的DNA 断片，电泳剖析时很难分清。定量PCR办法则绝对防止了这种事情状况的发生，错非目标基因DNA 断片在PCR引物处发生断开。两种办法剖析zui后结果的比较显露定量PCR办法剖析复印数更加管用、适合使用。