转基因植物的分子检测与鉴定方法（二）

1.1.2.2  降落PCR

TD-PCR是一种在一个反应管或少数几个反应管中通过一系列退火温度逐渐降低的反应循环来达到最佳扩增目的基因的PCR方案。它通过体系自身的代偿功能弥补以反应体系和并非完美的循环参数所造成的不足。此策略保证了最初形成的引物模板杂交体具最强的特异性。尽管最后一些循环采用的退火温度会降到非特异的Tm值，但此时的扩增产物已开始几何扩增，在余下的循环中处于超过任何非特异性PCR产物的地位，从而使PCR产物仍然呈现出特异性扩增。 R.H.Don等认为，PCR过程中的前几个循环对于扩增产物的纯度非常重要，因此前几个循环较高的退火温度，会增加引物与模板结合的特异性，TD-PCR方法可以阻止非特异性产物的形成。由于TD-PCR的策略是在较早的循环中避免低Tm值配对，故在TD-PCR中必须采用热启动技术。

1.1.2.3  rpPCR

由于外源基因整合到目标基因组时常发生重排，因此Southern杂交并不能清楚地分析转基因的拷贝数和整合情况。Kumar和Fladung在研究转基因杨树的外源基因整合行为时发明了rpPCR方法。这种方法就是利用不同的引物进行配对，对基因组DNA扩增，根据不同的引物对的扩增情况及产物的大小来推定 T-DNA的拷贝数、整合情况及拷贝的完整性等信息。与Southern杂交相比，该法的优点在于能比较方便快捷地指出重复单位是否完整，并能表明这种重复的方向。此方法的不足之处是在有多拷贝整合在不同的染色体上时不能显示作用。

1.1.2.4 反向PCR

IPCR与普通PCR相同之处是都有一个已知序列的DNA片段，引物都分别与已知片段的两末端互补。不同的是对该已知片段来说，普通PCR两引物的3’--末端是相对的，而IPCR则是相互反向的。因而 IPCR可以扩增已知序列片段旁侧的未知序列。根据这一特点，可以对外源基因在植物基因组中整合的拷贝数进行分析，多拷贝多位点整合时，扩增产物在电泳图谱上呈现多条带，单拷贝时只得到一条带。

然而，该技术要求DNA模板复杂度低于109bp，如果高于此值，则不能获得理想的效果。另外，自连接(环化)的效率也是限制该技术成功的因素。

1.1.2.5  实时定量PCR

实时定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其特点是：特异性好，实时定量PCR技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的准确性，假阳性低；灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控；线性关系好，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小；操作简单，自动化程度高，实时定量PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少；没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。

1.2  Southern杂交

Southern杂交是利用经过标记的DNA、RNA探针与靶DNA进行特异性杂交，分析外源基因在植物染色体上的整合情况(如拷贝数、插入方式)以及外源基因在转基因后代的稳定性问题。Southern杂交可以不受操作过程中的DNA污染影响和清除转化中的质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高，特异性强，是研究转基因植株外源基因整合最可靠的方法。已广泛应用于水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、桃等各类作物转基因植株的检测。然而该方法程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高，使其使用受到了限制。

2  外源基因在转化植株中是否转录的检测与鉴定

2.1  Northern杂交

外源基因在转化植株中的转录水平可以通过细胞总RNA和mRNA与探针杂交来分析，称为Northern杂交，它是研究转基因植株中外源基因表达及调控的重要手段。Northern杂交程序一般分为三个部分：植物细胞总RNA的提取探针的制备印迹及杂交。Northern杂交比Southern杂交更接近于目的性状的表现，因此更有现实意义。但Northern杂交的灵敏度有限，对细胞中低丰度的mRNA检出率较低。因此在实际工作中更多的是利用RT-PCR(reverse transcription PCR)技术对外源基因的转录水平进行检测。

2.2  RT-PCR

RT-PCR的原理是在反转录酶作用下，以待检植株的mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板扩增出特异的DNA。因此，RT-PCR可在mRNA水平上检测目的基因是否表达。RT-PCR十分灵敏，能够检测出低丰度的mRNA，特别是在外源基因以单拷贝方式整合时，其mRNA的检出常用RT-PCR。

Samia Djennane等把烟草硝酸还原酶基因Nia2经农杆菌介导导入马铃薯，经RT-PCR分析，Nia2基因在转基因马铃薯体内RNA水平得到表达。

由于RT-PCR是在总RNA或mRNA水平上操作，检测过程中必须注意RNA的降解和DNA的污染，另外还要设置严格的对照来防止假性结果的出现。