转膜时甲醇的作用

　　转膜

　　将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如 NC 膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

　　转移膜的选择

　　杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。最常的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和 NC 膜的特点相似,主要用于核酸杂交。

　　硝酸纤维素（NC）膜

　　NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便；韧性较差，易损坏。

　　聚偏二氟乙烯(PVDF)膜

　　PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。

　　膜的选择主要根据

　　1、 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量） ，以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小） ；

　　2、不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好） ；

　　3、如果后继实验有其他要求， 比如要做蛋白测序或者质谱分析， 还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

　　转膜注意事项

　　1

　　泡膜

　　转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移 buffer 浸泡 20min。

　　a. 凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。

　　b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。

　　2

　　转膜顺序

　　阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板。

　　3

　　转膜条件

　　a. 冰浴中进行转膜（转膜过程产生大量的热，注意冷却）；

　　b. 具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。

　　4

　　其它注意事项

　　a. 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

　　b. 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。

　　c. 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。

　　d. 鸡来源的抗体与 PVDF 和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC 膜） 。