软琼脂克隆形成实验

细胞样品

胰蛋白酶 胎牛血清 GIMSA染液 PBS 纯甲醇

培养皿 培养箱 显微镜

1. 取对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化，离心收集细胞沉淀。

2. 完全培养基重悬，适当稀释后活细胞计数，调整细胞密度至1×10³／ml。

3. 取0.5ml细胞悬液（即500个细胞），加入培养基，使体积达到9.4ml，37℃孵育。

4. 底层琼脂的制备。5％琼脂置沸水浴中，使之完全融化，取出1ml移人无菌小烧杯中，待冷却到50℃时，迅速加入9ml预温37℃的完全培养基，混匀后立即取0.8ml浇注24孔板，室温凝固。

5. 上层琼脂的制备。步骤3中预温的9.4ml细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5％琼脂，迅速混匀，立即取0.8ml浇入24孔板，置室温凝固。每孔即含有40个细胞，一般每个实验组重复3个样本。

6. 常规培养2——3周。

7. 将培养板置于显微镜下计数克隆数，每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆，以公式集落数=n孔中细胞集落数总和／n，克隆形成率=集落数／接种细胞数x100％计算克隆形成率，最后拍照。

8. 统计学分析。根据集落数和克隆形成率进行t检验，分析不同组别之间的差异。

1. 取对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化，离心收集细胞沉淀。

2. 完全培养基重悬，适当稀释后活细胞计数，调整细胞密度至1×10³／ml。

3. 取0.5ml细胞悬液（即500个细胞），加入培养基，使体积达到9.4ml，37℃孵育。

4. 底层琼脂的制备。5％琼脂置沸水浴中，使之完全融化，取出1ml移人无菌小烧杯中，待冷却到50℃时，迅速加入9ml预温37℃的完全培养基，混匀后立即取0.8ml浇注24孔板，室温凝固。

5. 上层琼脂的制备。步骤3中预温的9.4ml细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5％琼脂，迅速混匀，立即取0.8ml浇入24孔板，置室温凝固。每孔即含有40个细胞，一般每个实验组重复3个样本。

6. 常规培养2——3周。

7. 将培养板置于显微镜下计数克隆数，每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆，以公式集落数=n孔中细胞集落数总和／n，克隆形成率=集落数／接种细胞数x100％计算克隆形成率，最后拍照。

8. 统计学分析。根据集落数和克隆形成率进行t检验，分析不同组别之间的差异。

1. 在进行软琼脂克隆形成实验时，首先细胞计数要准确，可以重复计数，取平均值。其次在实验的操作过程中，很多步骤可能会引起污染，这个问题一定要注意。

2. 在将细胞悬液和琼脂混合的时候，一定要把握好琼脂的温度，太高时，容易引起部分细胞死亡，太低则容易使局部结块。

3. 关于选择接种多少细胞的问题，24孔板一个孔，30——50个细胞已足够。太少，结果不准确；太多，计数太麻烦。当然，这还要根据细胞增殖能力或者说恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常强时，可选择少接种一些细胞；当细胞增殖能力很弱时，可增加细胞接种数。

4.来源《分子生物学实用实验技术》。