过氧化物酶标记测定细胞凋亡

本实验用过氧化物酶标记测定了细胞凋亡。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。

实验原理

脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

主要试剂

1. 磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐50mM，NaCl200mM。

2. 蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K0.02g；PBS100ml。

3. 含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O22.0ml；PBS缓冲液98.0ml。

4. TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱3.63g用0.1NHCl调节pH至7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g。

5. TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl，混匀，置于冰上备用。

6. 洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17.4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O1000ml。

7. 0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB5mg；PBS10ml，pH7.4,临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。

8. 0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。

9. 100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10. 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）。

实验步骤

1. 标本预处理：
   

1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。

2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5×107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
2. 色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。
3. 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min。
4. 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加54μlTdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5. 将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

6. 组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。

7. 用PBS洗4次，每次5min。

8. 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。

9. 用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10. 于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。

11. 用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

注意事项

一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。