近期《自然》期刊系列中发挥关键作用的赛默飞质谱仪

发布时间：2012-01-16 11:26 原文链接：近期《自然》期刊系列中发挥关键作用的赛默飞质谱仪

　　　【导语】在2011年10-11月期间，在一级科学刊物Nature和Nature Methods上有14篇科研论文使用赛默飞世尔LTQ-Orbitrap或TSQ质谱仪产生数据，聚焦的主题包括：目标物发现与定量研究，Top-down蛋白质组研究绘制蛋白质异构体，同位素标签方法的精度，提高糖蛋白质组的鉴定产率，基因沉默引起的核酸内切酶活性研究，真菌效应器引起的代谢变化，细胞凋亡研究等。下面请小编带您概览一下这些文献及其创新之处，作为对2012新年的献礼，希望对您的研究工作有所启发，也希望您的工作可以更快地更多地发表在这些top journal上……

在2011年10-11月其间，在一级科学刊物Nature和Nature Methods上有14篇科研论文使用赛默飞世尔LTQ-Orbitrap或TSQ质谱仪产生数据。这14篇科研论文的主题包括：目标物发现与定量研究，Top-down蛋白质组研究绘制蛋白质异构体，同位素标签方法的精度，提高糖蛋白质组的鉴定产率（Steentoft等），基因沉默引起的核酸内切酶活性研究，真菌效应器引起的代谢变化，细胞凋亡研究等。

整个科学界都知道，在《自然》期刊上发表文章是非常著名的，这些文章往往是被高引用的文章，这可能会导致促销、基金资助等，并得到主流媒体的关注。在现代历史上多次最重大的科学突破都被首次刊登在《自然》上。大多数期刊往往是专门化的，而《自然》往往跨越不同领域，因此其审核的标准是非常严格的。《自然》的确是排名第一的期刊，从事研究的科学家们是该期刊的主要读者，而它的摘要和伴随摘要的文章往往是最重要的文献，并可被其它领域的科学家们和受过教育的广大公众很好地理解。

　　下面我们就来一睹为快：

　　1、Rapid empirical discovery of optimal peptides for targeted proteomics

　　 基于实验快速发现适合用于目标蛋白质组学定量的最佳肽段　　

A.B. Stergachis et al. Nature Methods. 2011 Nov 6;8(12):1041-3. doi: 10.1038/nmeth.

　　问题：如何选择最优化的酶解肽段，既可以容易地被质谱检测，又具有目标蛋白质定量需要的特征碎裂方式

　　仪器：TSQ Vantage三重四极杆质谱仪，LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪

　　解决方法：作者报道了一种可规模化、经济的方法，基于实验基础来产生合适的且具有好的碎裂方式的酶解肽段。比起依靠不完善的谱图数据库、理论预测算法、合成肽段，或购买全序列蛋白质，作者收集标签cDNA克隆体来体外合成全序列蛋白质，再用trypsin酶解和MS进行SRM分析。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：体外合成全序列蛋白质采用Thermo Scientific旗下品牌Pierce的人类体外蛋白质表达kit。用于绝对定量的重标肽段购于Thermo。SRM方法建立由Skyline软件完成但也可以用Thermo的Pinpoint软件完成。用Q Exactive也可以，和该文中TSQ Vantage一样，进行方法建立和重组蛋白分析。

　　2、MS³ eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics

　　 MS³减少同位素标记定量蛋白质组学实验中的比率失真

　　L. Ting et al. Nature Methods. 2011 Oct 2;8(11):937-40. doi: 10.1038/nmeth.1714.1770.　　

　　问题：同位素标记实验中，选择用来碎裂的母离子会影响数据的准确度和精确度，目标离子附近的同位素离子峰会被同时选择和碎裂，影响报告离子强度的准确性。

　　仪器：LTQ Orbitrap Velos

　　解决方法：作者选择MS³代替MS²来进行定量和鉴定，从而消除MS2中被选择的母离子被具有相似m/z值得离子干扰。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：要能使用MS³消除报告子比率失真，需要LTQ-Orbitrap的MSⁿ功能。最新的Orbitrap Elite具有更快的扫描速度，可以提供更多的肽段/蛋白质鉴定和定量。

　　3、Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging

　　气相纯化带来准确、多通道的同位素标签蛋白质定量

　　C. Wenger et al. Nature Methods. 2011 Oct 2;8(11):933-5. doi: 10.1038/nmeth.1716.　　

　　问题：同位素标记定量中定量数据的准确性和精确性

　　仪器：LTQ Orbitrap Velos ETD

　　方法：介绍了一种新方法叫做“QuantMode”：选取母离子，用ETD的阴离子碰撞使其价态减小，假设之前被一起选中的（“co-selected”）具有相同m/z的干扰离子具有不同的价态，在价态减小之后，目标离子和干扰离子的m/z不再相同，可以被更精确地选取出来。

　　选取出的价态减小的离子用HCD裂解，同样的母离子再次用离子阱的CID裂解，结果产生了经过对同一目离子优化碰撞能后的两个系列的碎片离子。HCD裂解含有不受影响的报告子，CID给出离子序列信息，这两组离子用C trap收集后一起送入Orbitrap分析，优点在可以提高测量的准确性。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：需要用ETD技术来获取价态减小的离子。

　　4、Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics

　　 Top-Down蛋白质组学绘制完整蛋白质异构体

　　J. Tran et al. Nature. 2011 Oct 30;480(7376):254-8. doi: 10.1038/nature10575.　　

　　问题：提高自上而下（top-down）蛋白质组学有限的覆盖率

　　仪器：Orbitrap Elite和LTQ FT

　　方法：用四维分析（二维电泳，LC和MS）鉴定人类细胞中1043个基因产物，这些产物又因为翻译后修饰（PTMs），RNA 剪切（splicing）和水解而衍生为3000多种蛋白质。整个系统的分离能力和蛋白质覆盖率提高了20多倍。该研究代表了迄今为止top-down质谱法在提高蛋白质组覆盖率方面的最高水平。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：Orbitrap Elite提高的分辨率和更快的扫描速度可配合LC做Top down分析。各种裂解方式结合（HCD，CID和ETD）提高序列覆盖率，从而鉴定和区分蛋白质异构体。

　　5、Mining the O-glycoproteome using zinc-finger nuclease–glycoengineered SimpleCell lines

　　 利用锌指核酸酶-糖化设计的简单细胞系来挖掘O-糖蛋白质组

C. Steentoft et al. Nature. 2011 Oct 30;480(7376):254-8. doi: 10.1038/nature10575.　　

　　问题：基于RNAi的基因沉默技术还未被证明对细胞的糖基化工程（glycoengineering）有效，可能是因为在内质网（ER）-高尔基体膜积累中糖基转移酶发挥作用，减慢了转化。

　　仪器：LTQ Orbitrap XL ETD

　　方法：基于锌指核酸酶（ZFN）的基因打靶技术是一种独特的工具，可高特异性地使基因变异。作者使用COSMC（b1,3-GT的重要的特异性蛋白伴侣）的ZFN基因打靶，对稳定的、带有简单O－糖基化的人类细胞株进行糖基工程化改造，显示只有截断的Tn和STn O -聚糖，被称为“SimpleCell'系（简单细胞系）。

　　简单细胞系使作者使用修饰后的LWAC 凝集素色谱柱和nLC-MS/MS（纳升液相色谱-串联质谱）技术，来研究人类细胞的O-糖基化蛋白质组，发现了许多O-糖蛋白和糖基化位点，包括以前未被鉴定过的酪氨酸残基连接位点。作者鉴定了100多个O-糖蛋白和350多个糖基化位点（很多是以前从未报道过的），包括一个酪氨酸残基的GalNAc O-聚糖连接位点。文章中强调了用ETD技术鉴定糖肽，以及用HR/AM技术监测糖链水合氢离子这两种功能的重要性。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：多种裂解技术（HCD和ETD）对于表征完整糖肽的重要性。用HCD来鉴定糖链结构/组成，ETD鉴定肽段序列和糖基化位点。只有赛默飞仪器才能实现的HCD-PD-ETD策略可以提高duty cycle和动态范围，比交替的数据采集方法，HCD-PD-ETD可鉴定出更多的O-糖肽。

　　相关名词释义：

　　基因打靶技术(Gene targeting technology)：是指通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。

　　COSMC：核心I b3-半乳糖基转移酶特异性分子伴侣，COSMC是 b1,3-GT的重要的特异性蛋白伴侣。

　　cell line 细胞系：可以在试验室培养的、可以储存的纯化的具有某些特定基因特征的细胞。

　　6、The endonuclease activity of Mili fuels piRNA amplification that silences LINE1 elements

　　Mili核酸内切酶的活性刺激piRNA的扩增，沉默LINE1元素

　　S. De Fazio et al. Nature. 2011 Oct 23;480(7376):259-63. doi: 10.1038/nature10547.

　　问题：研究Piwi催化的内切核苷酸的活性

　　仪器：LTQ Orbitrap Velos

　　方法：基因工程方法。为研究Piwi催化的内切核苷酸的活性，作者在小鼠上设计了突变点，在DDH催化Mili和Miwi2的实验中，将第二个天冬氨酸取代为丙氨酸，分别产生Mili^DAH和Miwi2^DAH等位基因。分析来源于纯合Mili^DAH胎儿配子母细胞的Mili键合的piRNAs，显示转位子piRNA扩增失败，导致在Miwi2核糖核酸微粒中连接的piRNA的标记还原。本文用质谱来分析野生型和Mili^DAH P10 睾丸中的Mili复合物，从而帮助研究这些过程。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：LTQ Orbitrap Velos的HR/AM和快速的MS/MS数据采集，帮助获得更高的蛋白序列覆盖率和更多的肽段鉴定数。另外，LTQ Orbitrap Velos的深入挖掘能力，还可从含有角蛋白，胰酶和免疫球蛋白这些高丰度干扰物的样品中发现低丰度的蛋白。

　　对该文献相关的报道：

　　Nature：Piwi蛋白在转位子沉默中的作用

　　近日，国际著名杂志Nature刊登了意大利研究者的最新研究成果“The endonuclease activity of Mili fuels piRNA amplification that silences LINE1 elements。”

　　Piwi蛋白与同它们相关的“Piwi相互作用RNA”（piRNA）的组合，调控动物生殖细胞系中的“外成转位子沉默作用”。Piwi蛋白被预测是核酸内切酶，但这种活性的重要性过去却未在活体中演示过。现在，Dónal O\'Carroll 和 Ramesh Pillai的实验室已培育出了小鼠模型，在其中，预计对在小鼠的三个Piwi蛋白Mili、Miwi 和 Miwi2中的核酸酶活性至关重要的残体都发生了突变。突变的小鼠表现出表现型差异。Mili 和 Miwi突变体在piRNA生成、转位子沉默作用和繁殖力方面是有缺陷的，而Miwi2突变体则有正常的piRNA水平，似乎在进行piRNA放大，并且使转位子沉默。这些研究凸显了负责piRNA生物生成的鼠科动物的各种酶之间的差别。

　　7、Cascades of multisite phosphorylation control Sic1 destruction at the onset of S phase

S期多磷酸化位点控制的Sic1降解

　　M. Koivomagi et al. Nature. 2011 Oct 12;480(7375):128-31. doi: 10.1038/nature10560.

　　问题：研究Sic1多磷酸化位点机理

　　仪器：LTQ Orbitrap

　　方法：通过精确的导向对接相互作用（在Sic1和Cks1中特定细胞周期对接的生物序列）可形成多磷酸化过程的路线。该研究中用质谱定量研究Cks1的T48磷酸化。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：具有多种裂解方式（HCD，CID，ETD）的IT-Orbitrap，可以全面地鉴定磷酸化肽段和磷酸化位点，特别是在Orbitrap上可以采用数据相关自动多级碎裂树（data dependent decision tree, DDDT）的方法。

　　8、Metabolic priming by a secreted fungal effector

　　由分泌的真菌效应器引起的代谢变化

　　A. Djamei et al. Nature. 2011 Oct 5;478(7369):395-8. doi: 10.1038/nature10454.

　　问题：研究 U. maydis分泌的分支酸变位酶Cmu1为致病因子

　　仪器：LTQ FT

　　方法：研究被玉米黑粉菌（U. maydis）菌株感染的玉米细胞间隙液蛋白质组，发现植物克隆/定植过程中Cmu1的分泌。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：HR/AM和快速MS/MS数据采集帮助获得更高的蛋白序列覆盖率和更多的肽段鉴定数。可用Orbitrap提高性能。

　　9、Saccharomyces cerevisiae THI4p is a suicide thiamine thiazole synthase

　　 酿酒酵母THI4p是一种自杀性硫胺噻唑合酶

　　A. Chatterjee et al. Nature. 2011 Oct 26;478(7370):542-6. doi: 10.1038/nature10503.　　

　　问题：制备具有活性的重组野生型THI4p，这种基因产物参与真核细胞中噻唑的生物合成，并且证明THI4p为仅存在单个周期的自杀性酶。

　　仪器：LTQ FT

　　方法：MS用于测定由大肠杆菌表达的重组野生型THI4p的初始分子量，比理论分子量低34Da。而未与代谢物结合且无任何活性的THI4p8的活性位点突变体并没有被修饰，表明34Da的质量丢失在某种程度上和蛋白的催化活性有关。为了定位这个修饰位点，修饰的wtTHI4p用胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）酶解后用MALDI和FT-MS分析肽段碎片。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：HR/AM可测定精确分子量，也可鉴定肽段序列和定位PTMs。这些实验在IT-Orbitrap上更容易被实现，可利用多种裂解方式获得更高的肽段覆盖率和更多的PTMs位点。

　　10、Global profiling of dynamic protein palmitoylation

　　 全面分析动态的蛋白质棕榈酰化

　　B. R. Martin et al. Nature Methods. 2011 Nov 6;9(1):84-9. doi: 10.1038/nmeth.1769.　　

　　问题：研究棕榈酰化的动态调控

　　仪器：LTQ Orbitrap Velos

　　方法：结合17-ODYA代谢物标记，SILAC标记和MS准确鉴定和定量富集的棕榈酰化蛋白质。在鼠T-cell hybridoma cells里鉴定和定量了400多种棕榈酰化蛋白。通过17-ODYA代谢脉冲追踪标记，可区分快速转化和固定修饰的棕榈酰化蛋白。最后利用特异性脂肪酶抑制因子，发现一组特别的酶调节的棕榈酰化蛋白。这些发现从大量蛋白质棕榈酰化中，区分出了一批特别的由水解酶动态调节的棕榈酰化蛋白。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：超高分辨率，如Orbitrap提供的>100,000的分辨率对于SILAC实验的精确鉴定和定量是必须的。

　　11、S-nitrosylation of NADPH oxidase regulates cell death in plant immunity

　　 NADPH氧化酶的S-亚硝基化调节植物免疫中的细胞凋亡

　　B. Yun et al. Nature. 2011 Oct 13;478(7368):264-8.

　　问题：研究NADPH氧化酶是否可能发生S-亚硝基化

　　仪器：LTQ Orbitrap XL

　　方法：MS分析结果和Cys 890的S-亚硝基化结构一致。这些研究结果总体表明，AtRBOHD特别是在S-890体外S-亚硝基化。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：Orbitrap超高的质量准确度和高分辨，可以获得可信的序列结果。

　　12、Molecular mechanism of anaerobic ammonium oxidation

　　 厌氧氨氧化菌的分子机制

　　B. Kartal et al. Nature. 2011 Oct 2;479(7371):127-30. doi: 10.1038/nature10453

　　问题：研究厌氧脱氮机制相关的基因和蛋白，纯化可催化N₂H₄合成和氧化为N₂的关键酶。

　　仪器：LTQ FT

　　方法：蛋白质组学方法

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：HR/AM和快速MS/MS数据采集帮助获得更高的蛋白序列覆盖率和更多的肽段鉴定数。可用IT-Orbitrap鉴定更多肽段和蛋白。

　　13、A heteromeric Texas coral snake toxin targets acid-sensing ion channels to produce pain

　　 异聚德克萨斯州银环蛇毒素作用于酸敏感的离子通道产生疼痛感

　　C. J. Bohlen et al. Nature. 2011 Nov 16;479(7373):410-4. doi: 10.1038/nature10607　　

　　问题：鉴定蛇毒液可激活躯体感觉神经元

　　仪器：LTQ Orbitrap

　　方法：毒液中主要活性成分为MitTx-a和MitTx-b。质谱用于鉴定这些是否为蛋白质。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：超高质量准确度和高分辨可以获得可信的序列结果。

　　14、Evolution of a new enzyme for carbon disulphide conversion by an acidothermophilic archaeon

　　一种嗜酸硫氧化细菌中一个新的二硫化碳转化酶的演变

　　M. J. Smeulders et al. Nature. 2011 Oct 19;478(7369):412-6. doi: 10.1038/nature10464.

　　问题：找到Acidianus A1-3的CS2水解酶的结构，可能机制和演变过程

　　仪器：LTQ FT

　　方法：Acidianus A1-3细胞的CS2转化酶（亚基分子量24kDa）是CS2水解酶。用LTQ FT鉴定CS2水解酶序列证明CS2水解酶是否由Acidianus A1-3细胞纯化。

　　选择的或可供选择的赛默飞产品：LTQ FT的HR/AM可得到高序列覆盖率。这些实验也可在IT-Orbitrap上实现，获得更高的覆盖率。

长期以来，赛默飞世尔科技质谱产品以其卓越的技术性能与持续的创新精神，深受专业用户的青睐，也当之无愧地成为帮助科研工作者获取尖端成果的利器神兵。这十四篇Nature文章就是又一力证。

　【附录】

　　名词解释：

　　HR/AM：高分辨率/精确质量

　　HCD：高能诱导解离

　　CID：碰撞诱导解离

　　ETD：电子转移解离

　　LTQ Orbitrap系列的工作原理：

　　LTQ Orbitrap是整合了线性离子阱质谱仪和轨道阱质量分析器的组合式高分辨质谱仪系统。大气压离子源处产生的离子在LTQ质量分析器被捕获。而一旦处于离子阱中，这些离子就可以通过LTQ的MS或MSn 等扫描模式进行分析。或者---离子从LTQ轴向排出，进入一个C-形离子阱(C-trap)，再经过C-trap进入Orbitrap质量分析器。通过快速增加Orbitrap中心电极的电压可将C-trap来的离子捕获，捕获的离子围绕中心电极做环形运动并沿中心电极轴向振动。

　　来自轨道阱外电极的信号经过放大后，通过快速傅立叶变换得到频谱,而频率最终被转换成质谱图。另外LTQ Orbitrap还有一个新型碰撞池能够提供额外的二级质谱实验。离子被选择性的保留在线性离子阱中，可以通过离子阱碰撞诱导解离(CID)或者新型高能诱导断裂(HCD)。高能碰撞诱导解离离子经过C-trap到达充满气体的碰撞池。高能诱导解离的二级质谱实验中，标准化的碰撞能量可以在不同的仪器之间提供重复的数据。