逆转录PCR的实验步骤

 一、实验器具与材料：

     1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸头：1ml、200μl、20μl

3、匀浆管：5ml

4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）；1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）

7、量筒：50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

9、试管架：5ml、1.5ml、20μl

10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水

11、铝制饭盒：4个

12、塑料小饭盒：1个

13、大瓷缸：2个

14、锡泊纸：一卷

15、卷纸：2卷

16、三角烧瓶：带盖，稍大

     二、实验器具的处理与准备

     1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）

2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）

3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）

     三、试剂配制：

1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）

3、异丙醇：放入棕色瓶中

4、氯仿：放入棕色瓶中

5、琼脂糖

     四、几种缓冲液的配制：

     1、电泳缓冲液：

Tris 54g
     硼酸 27.5g
     0.5M EDTA 20ml  pH8.0
     蒸溜水 1000ml
     5×TBE （贮存液）
     再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液

     2、上样缓冲液：

0.25%溴酚蓝
     0.25%二甲苯青FF
     30%甘油
     6×缓冲液，4℃保存

     五、琼脂糖凝胶的配制：

1、1.0%：  1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。

2、1.5%：   同上，将琼脂糖的量改为1.5g

     六、需购置的Rt-PCR材料：

Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
     dNTP: 1支
     oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
     M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
     RNasin: 1支 110
     -- -20℃
     DEPC 5g 110.00
     Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
      -- 4℃
     Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00

     七、引物合成

     1. 正义：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
     反义：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′

2、par-4:
     正义：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
     反义：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′

3、退火温度计算：
     2（A T） 4（G C）
     正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）

4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好

5、引物稀释：
     加DEPC水量为（μl）= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
     是为10p mol / μl 浓度的引物溶液

     八、PCR产物电泳

先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。

     九、几个注意点：

1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。

2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。

3、RNA抽提前，打开离心机预冷。