选择重组蛋白表达的合适方法（一）

一、引言

选 择 合 适 醜 组 蛋 白 表 达 方 法 对 于 能 否 及 时 获 取 所 需 数 量 和 质 量 的 重z组蛋白非常关键。选 择 了 错 误 的表达宿主可 能 导 致 蛋 白 质错 误 折 叠 或 低 量 表 达 . 缺 少 必要的翻译后 修 饰或不适当的修饰 。选 择 表 达 系 统时 需 騎 虑 的 因 素包括蛋 白 质 的 大 小 、二 硫 键的 数 目 、所 需 翻 译 后 修饰的 类型 及 目 标 蛋 自 质 的 定 位 。纯 化 后 的 重 组 蛋 自 的 期 应 用 在决 策 过 程 中 也 是 很 关 键 的 ，其 应 用 领 域 有 四 大 类 : 结 构 研 究 、体 外 活 性 分 析 、作 为 抗 原 制 备抗 体 和 体 内 研 究 。本 章 的 目 的 是 为 研 究 者 选 择 合 适 的 表 达 系 统 提 供 指 导 。然 而 ，即 便 凭借这 些 指导 原 则， 很 多 倩 况 下 仍 然 无 法 预 先 确 定 哪 种 表 达 系 统 是 最 合 适 的 ，要 想 找 到 最 理想 的 表 达 系 统 ，必 须 对 多 种 表 达 系 统 进 行 尝 试 。

目前，学术界和工业界正在使用大量的表达系统。其中的一些表达系统非常新，并未经过足够的尝试以评价其实用性。而且，一些已经建立的重组蛋白表达系统 (如转基因动物），在技术上极具挑战性，需要消耗大量时间，并且极为昂贵, 因此对于一般实验室而言并不是可行的选择。就本章而言，我们只讨论大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒/昆虫细胞及哺乳动物的表达系统(对这些表达系统更详细的介绍见第12〜1 5 章 ）。这 4 类表达系统都有简单易懂的操作方案，小量制备成本低廉，可以很容易从同行或科研产品公司（如Invitrogen、EMI>Novagen、 Stratagene和 P rom ega等）获得。下面将会对这几类表达系统的特点和可以进行的选择进行简要介绍, 在此重点关注它们之间的不同之处。最后我们会介绍一些策略以帮助研究者选择最合适的表达系统。

二、大肠杆菌

大 肠 杆 菌 是最早用于重组蛋白表达的宿主菌，其在蛋白质表达领域仍被认为是主要的工具。大肠杆菌较短的增殖时间使其成为一种简单快捷的重组蛋白表达系统。因此, 评估重组基因在大肠杆菌中的表达只需要不到1 周的时间。培养大肠杆菌的培养基价格低廉，而且已有简单直接的方法用于生产过程的放大(详 见 第 12章）。

在 大 肠 杆 菌 中 ，重 组 蛋 白 通 常 定 位 于 胞 质（cytoplasm) 中 ，也 可 以 定 位 于 周 质(periplasm) ，在少数情况下会分泌到胞外。定位于胞质的蛋白质的表达效率是最高的，其产量通常可以占总生物质(biomass) 的 3〇% (Jana and D e b , 2〇〇5)。然而，重组蛋白过高的表达可能会导致不溶性蛋白聚集体的累积，从而形成包涵体Gndusi〇nS b〇dy)。不只是真核生物来源的蛋白质会形成包涵体，少数情况下，包括大肠杆菌在内的过表达原核生物来源的蛋白质也会形成包涵体。在大肠杆菌中，蛋白质翻译和折叠的速率比在真核细胞中几乎高1〇倍，这可能是真核蛋白质形成包涵体的原因（Andersson et al.，1982;Goustin and W ilt，1982)。在某些情况下，包涵体大大妨碍了获得可溶的活性蛋白质。

不过，有时包涵体也能带来好处，其不易被蛋白酶降解，易于离心浓缩，很少被其他蛋白质污染，而且通过努力，也能将其再折叠成有活性的可溶性蛋白质(详 见 第 1 7 章）。

1.大肠杆菌： 温度和分子伴侣

已经有一些技术用于在胞质中尽可能多地形成可溶的正确折叠的蛋白质，而尽可能少地形成包涵体。最容易的方法是在蛋白质表达时降低温度至15〜30°C (Sahdevetal. ，2008)。据推测，降低温度会降低蛋白质转录、翻译和折叠的速率，从而使蛋白质能够正确折叠（V e r a e ta L , 2006)。此 外 ，研 究 显 示 ，低 温 还 会 降 低 热 休 克 蛋 白 酶（heatshock protease)的活性 (Spiess e ta L , 1999)。一些研究者通过在胞质中与重组蛋白共表达分子伴侣(molecular chaperone)来促进蛋白质的可溶性 (Young etal. , 2004)。该方法的运用似乎具有蛋白质特异性，因此需要针对每种目标重组蛋白分别进行实验(Baneyx and Mujacic，2004)。

2. 大肠杆菌： 融合标签

在重组蛋白的 N 端 或 C 端融合可溶性的融合标签(fusion tag)是提高许多重组蛋白可溶性的另一种方法(Esposito and Chatterjee, 2006)。已经证明能够提高重组蛋白可溶性的融合标签包括谷胱甘肽S转移酶如glutathione-S-transferase,GST)、硫氧还蛋白（thioredoxin)、麦 芽 糖 结 合 蛋 白（maltose-binding protein，M B P )、小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-modifier,S U M O )及 N u s A 标签（JV-utilization substrate)。其中 G S T 标签 和 M B P 标签还有另外的好处, 可以用做亲和纯化的标签。然而令人遗憾的是没有哪一种标签能够适用于所有的重组蛋白，必须对多种融合标签的促可溶表达能力进行评估。有多种策略可用于移除重组蛋白的融合标签，广泛的做法是在融合标签和重组蛋白之间插入蛋白酶酶切位点，然后使用特异性的蛋白酶将其切除。有时候，移除标签后重组蛋白可能会变得不可溶，所以必须对这一方法进行谨慎的测试。

3.大肠杆菌： 二硫键的形成

对于胞质表达，大肠杆菌通常不能促使重组蛋白二硫键(disulfide bond)的正确形成；由于二硫键氧化还原酶系统(Dsb system)催化作用的存在, 周质通常是大肠杆菌中唯一可形成二硫键的场所(Andersen e t a l.， 1997; Bardwell, 1994) 。 因此，如果重组蛋白需要形成二硫键，就需要利用一个可切割的信号肽（如 pelB)将其定位于周质。然而 ，周质表达的一个主要不利之处在于蛋白质的表达量会大大降低。硫氧还蛋白（thioredoxin) 和谷氧还蛋白（glutaredoxin) 能够促进胞质内半腕氣酸的还原反应，通过对大肠杆菌基因组的改造以破坏D sb系统的硫氧还蛋白还原酶基因（thioredoxin reductase gene「 trrB )和谷胱甘肽还原酶基（glutathione reductase gene,g o r), 就可以在胞质内创造更加适于二硫键形成的环境(Bessette e ta l.，1999)。这些基因工程改造的菌株已由EMI>Novagen(Origami)公司实现了商业化。如果需要形成更多的二硫键，可以将重组蛋白与硫氧还蛋白融合后在trxB-/gor””大肠杆菌菌株中进行表(LaVallie et aL ， 1993) 。

4. 大 肠 杆 菌 ： 翻译后修饰

最 后 ，必 须 认 识 到 相 比 于 真 核 生 物 ，大 肠 杆 菌 对 蛋 白 质 进 行 翻 译 后 修 饰 (posttranslational modification) 的 能 力 有 限 。例 如 ，大 肠 杆 菌 不 支 持 酶 介 导 的 N -连 接 的 糖 基 化 (iVlinked glycosylation)、0 连 接 的 糖 基 化（O l i n k e d glycosylation) 、酰 胺 化（amidation) 、轻基 化 (hydroxylation) 、豆 蘧 醜 化（myristoylation) 、棕 榈 酰 化 (palmitoylation) 和 硫 酸 化(sulfation)