透射电镜小鼠气管和眼睛的取材和包埋

实验概要

本实验要看小鼠气管内的cilia和眼睛中的primary cilia的”9 2”结构，故做透射电镜。

主要试剂

glutaraldehyde(EMS进口，电镜专用）

PFA

PBS or PB buffer

1-4% osmium tetroxide in buffer

0.5% uranyl acetat 

ethanol

epoxypropane

resin 

主要设备

通风橱

电镜

实验步骤

1.    取材：事先准备好所需的器械和固定液，并把它放4℃冰箱内预冷备用。气管和眼睛的镜取物均应在离体后迅速用生理盐水冲洗后或直接投入预冷的2.5%戊二醛固定液（保质期为1个月）内，并把它放4℃冰箱内保存，一般要求在两分钟内完成。在处理手术切除物时，应事先准备好两把锋利的刀片（如剃须刀或手术刀）和蜡板，把固定液滴在蜡板上，再把切下来的脏器用手术刀切成小块，放在蜡板上的固定液中，接着用双刀片拉锯法（具体做法请向我室工作人员咨询）在固定液中将组织切成约1立方毫米大小或横切面约1平方毫米的长条形，用剪刀把1ml的枪头建一个小口，然后轻轻的把1立方毫米的小块吸入装有固定液EP管中（最好是2ml的圆底EP管，这样可以充分浸入固定液，使固定充分）。做好标记，放入4℃，1h后换固定液，然后放入4℃，可以保存一个周。

2.  二次固定 ：用PB洗5次*10次，然后1%osmium tetroxide固定1h；

3.  染色：ddH2O洗5次*10min，铀染色2h；

4   脱水：30%ethanol  50%ethanol  70%ehanol（可4℃过夜）  90%ethanol  依次15min一次而后  100%ethanol  10min*2次   epoxypropane 10min*2次；

5.  浸透 ：1part resin/1part solvent(ddh2o) 3parts resin/1part solvent 依次2h以上-过夜   100%resin两小时以上或过夜    room temperature；

6.   包埋：为了加速resin的凝固速度，加入催化剂DMP-30，35ul到2mlresin,先用这种加入DMP-30的resin浸透2h左右，然后进行包埋。包埋是在包埋板中进行的，把含有催化剂的resin加入包埋板中的每一个小孔中，然后用牙签挑出一小块组织，放在小孔的一端，挑出另一块放在另一端，每一个做一个平行。而后把包埋板放入60℃烘箱，48h或更久使包埋块凝固形成。

注意事项

 1.  取材注意事项：电镜生物样品制备的关键在于制出的样品必须忠实地反映其生活时的状态，尽量避免“死后改变”和人为假象的发生，因此，取材这一步非常重要。取材要求如下：

      1）冷：取材的器械和固定液均应事先在4℃冰箱内预冷。

      2）快：取材时动作要快，所用的刀片要锋利，一般要求在脏器离体后1—2分钟内取材完毕并放入2.5%戊二醛固定液内于4℃冰箱内保存。另外，应避免对组织的挤压和人为损伤。

      3）小：为了能让组织充分固定，必须把组织切成尽可能小的块，一般要求组织块在1立方毫米左右或横切面为1平方毫米的长条形,长度一般不超过3毫米，而皮肤、肌腱等组织较致密，取材应在1立方毫米以内。

      4）准：由于电镜标本要求小块取材，为了电镜观察的准确性，取材部位必须要准确，而且，不同实验组的标本尽量取在相同部位（如心肌组织取左心室，则一律取左心室），否则，将无法比较，进而影响观察结果，最终导致电镜观察失败。

      5）不同的组织可能要求不同的固定液，如气管用2.5%glutaraldehyde 2%PFA ，而眼睛用2.5%glutaraldehyde。

2.    脱水和浸透以及洗的过程中不要让组织块脱了液体，以免干掉。锇酸剧毒，应在通风橱中操作，铀具有放射性，也应在通风橱中，并且操作过程中用到的吸头要集中处理。