通过重叠延伸和基因SOEing进行PCR突变实验

试剂、试剂盒 无菌 H2OPCR 缓冲液限制性酶和缓冲液Taq DNA 聚合酶PCR 模板5'和 3'引物dNTP

仪器、耗材 DNA 测序装置热循环仪琼脂糖凝胶电泳设备

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

无菌 H2O

2. 酶和酶缓冲液

10XPCR 缓冲液（Roche)，包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/L，KCl 和 15 mml/LMgCl2(参见 32.3 注释/评价 4，以决定恰当的 Mg2+浓度）。

限制性酶和缓冲液（参见步骤 8 和 32.3 注释/评价 6）

Taq DNA 聚合酶（Roche)

3. 核酸和寡核苷酸

10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液（AmershamBiosciences) 是 100umol/L 浓度的储存液，可以用无菌水稀释。

PCR 模板（参见 32.3 注释/评价 3)

5'和 3'引物（参见 32.3 注释/评价 2）

4. 特殊设备

DNA 测序装置（参见 32.3 注释/评价 6)

热循环仪

5. 其他

琼脂糖，分离 DNA 片段所需的琼脂糖浓度依赖于需要分离的片段的大小。依经验，0.8%~1% 的 SeaKem GTG 琼脂糖（Cambrex)(用 1XTAE 配制）一般都能够令人满意地分离 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。

琼脂糖凝胶电泳设备

GENECLEANⅡ试剂盒（BIO101)

6. 载体和菌株

PCR 产物测序所需的克隆载体和菌株。

二、方法

1. 通过重叠延伸进行 PCR 突变

（1）在独立的微量离心管中进行 PCR 反应生成产物 AB 和 CD(参见图 32-1)。这些反应混合物能够在室温下混合。有关引物和模板浓度可以参见 32.3 注释/评价 2 和 3。

（2）反应进行 30 个循环（94°C 1min,50°C 1min,72°C 2 min)。

（3）将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。

（4）切下目标条带（即产物 AB 和 CD)，用 GENECLEANUⅡ试剂盒回收 DNA 片段。

（5）在一个新的微量离心管中进行重叠延伸反应。

这一反应对于加入的模扳量不十分敏感。通常每种模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反应的开始就加入。

（6）参照上面的步骤 2 进行 PCR 扩增。

（7）将反应物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目标条带（即产物 AD)，参照步骤 4 回收 DNA片段。

（8）纯化的突变产物 AD 随后可以被适当的限制性酶所消化，然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序（参见 32.3 注释/评价 6）。

2. 基因 SOEing

（1）在独立的微量离心管中进行 PCR 反应，以分别产生来自基因 1 的产物 WX 和来自基因 2 的产物 YZ(图 32-2)。关于引物和模板的浓度参见 32.3 注释/评价 2 和 3。

（2）反应进行 30 个循环（94°C lmin,50°C lmin，72°C2 min)。

（3）将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。

（4）切下目标条带（即产物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 试剂盒回收 DNA 片段。

（5）在一个微量离心管中进行 SOEing 反应。

（6）参照上面的步驟 2 进行 PCR 扩增。

（7）将反应物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目标条带（即产物 WZ), 参照步骤 4 回收 DNA 片段。

（8）纯化的突变产物 WZ 随后可以被适当的限制性酶所消化，然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序（参见 32.3 注释/评价 6）。